引用本文
宋振, 宋三平, 凃政, 赵杰, 贺永锋. 两种提取骨骼、牙齿DNA的方法[J].刑事技术, 2018,43(1):39-42
SONG Zhen, SONG Sanping, TU Zheng, ZHAO Jie, HE Yongfeng. Two Methods for Extracting DNA from Ordinary and Aged Bones or Teeth[J]. Forensic Science and Technology,2018,43(1): 39-42  
doi: 10.16467/j.1008-3650.2018.01.008
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《刑事技术》编辑部
两种提取骨骼、牙齿DNA的方法
宋振1, 宋三平1, 凃政2, 赵杰1, 贺永锋1,*
1. 陕西省公安厅刑侦局,西安 710018
2. 公安部物证鉴定中心,北京 100038
* 通讯作者：贺永锋（1978—）,男,陕西三原人,学士,副主任法医师,研究方向为DNA检验鉴定。E-mail: hyfclp@126.com

第一作者简介：宋振（1983—）,男,山东济宁人,硕士,主检法医师,研究方向为DNA检验鉴定。E-mail: songzhen006@163.com

摘要

目的 建立提取骨骼、牙齿DNA的新方法。方法 收集380例骨骼、牙齿检材,其中347份为常规骨骼、牙齿（常规组）,33份为陈旧骨骼、牙齿（疑难组）。常规组检材以Handy-Eco仪器、疑难组则用冷冻研磨仪研磨成粉,以Kingfisher自动化系统提取DNA,用Identifiler Plus进行STR分型检测。结果 用Handy-Eco Kingfisher法（H-K法）成功提取345例常规骨骼、牙齿检材的DNA,成功率99.42%;用Freeze-mill Kingfisher法（FM-K法）成功获取32例疑难骨骼、牙齿检材的DNA,成功率96.97%。结论 采用H-K法和FM-K法对骨骼和牙齿DNA的检验成功率较高,可选择应用于工作实践中。

关键词: 骨骼; 牙齿; DNA提取; STR分型; Kingfisher自动化系统
中图分类号:DF795.2 文献标志码:A 文章编号:1008-3650(2018)01-0039-04
Two Methods for Extracting DNA from Ordinary and Aged Bones or Teeth
SONG Zhen1, SONG Sanping1, TU Zheng2, ZHAO Jie1, HE Yongfeng1,*
1. Department of Criminal Investigation of Shaanxi Provincial Public Security Bureau, Xi’an 710018, China;
2. Institute of Forensic Science, Ministry of Public Security, Beijing 100038, China
Abstract

Objective To set up new methods for the extraction of DNA from ordinary and aged bones or teeth.Methods 380 pieces of bone and tooth, 347 ordinary and 33 aged ones, were collected from the previous routine casework. Handy-Eco instrument was selected to grind the ordinary samples into powder while the aged by Freezer Mill apparatus to achieve the same efficacy. DNA was extracted from the above-processed samples with Kingfisher automatic system (thus the H-K and FM-K methods), with the Identifiler Plus kit to test the STR profile.Results DNA was shown of 15 autosomal STR loci of Identifiler Plus from the 345 ordinary samples, presenting the extraction rate as 99.42%. 32 aged samples exposed their 15 autosomal STR loci of Identifiler Plus, bringing up the DNA extraction rate about 96.97%.Conclusion The established methods here are efficient to extract DNA from either the ordinary or aged bones/teeth, applicable in forensic practice.

Key words: bones and teeth; DNA extraction; STR typing; Kingfisher automatic system

骨骼和牙齿的组织结构可有效保护骨细胞与牙釉质, 故而能抵抗外界环境因素的影响[1]。因此, 对高度腐败及白骨化的尸体进行尸源鉴定, 从骨骼和牙齿中提取DNA并进行STR分型检验是可赖以利用的重要技术手段。但传统脱钙法存在提取时间长、有机纯化试剂有毒、得到的DNA浓度低及易于污染等缺点[2, 3, 4], 特别是当检材为陈旧骨骼、牙齿时其提取成功率就更低。本文利用Handy-Eco仪器和Freezer Mill冷冻研磨仪结合Kingfisher自动化提取系统, 提取骨骼和牙齿DNA, 研究其对法医学检案的可应用性。

1 材料与方法
1.1 检材来源

本实验室日常检案积累的380例骨骼、牙齿检材, 分成常规和疑难两组：常规组包括347例骨骼、牙齿检材（保存年限：2年以内）; 疑难组包括33份陈旧骨骼、牙齿检材（其中8份为陈旧骨骼、最长保存年限46年; 25份为牙齿、保存年限最长者22年）。

1.2 主要仪器与试剂

9700型PCR扩增仪、3500型遗传分析仪、IdentifilerPlus试剂盒(Life公司); 骨骼专用磁珠法DNA提取试剂盒（长春博坤公司, Kingfisher提取仪专用）; Handy-Eco仪器（韩国世洋公司）; 6770-230FreezerMill冷冻研磨仪(SPEXSamplePrep公司); Kingfisher自动化提取系统(Thermo公司)。

1.3 检材预处理

1.3.1 常规组骨骼、牙齿预处理（保存2年以内）

取常规骨骼或牙齿检材, 用手术刀刮净表面, 清洗, 晾干, 以5 %次氯酸钠溶液处理15 min, 蒸馏水清洗3~4次, 无水乙醇浸泡一次, 除去残余水分, 紫外灯下照射20 min。将上述检材用Handy-Eco仪器研磨成粉, 取50~150 mg, 备用。

1.3.2 疑难组骨骼（牙齿）预处理（保存2年~46年）

骨骼与牙齿的前处理同1.3.1常规组。处理完毕后, 陈旧骨骼检材在完整股骨头一端取4~6块(1~2 g/块)骨碎片; 陈旧牙齿检材选取整个牙齿。将上述检材用6770-230 Freezer Mill冷冻研磨仪振荡研磨至粉末状, 备用。

1.4 检材DNA提取

1.4.1 Handy-EcoKingfisher法（H-K法）

1）按上述处理的常规组, 每份取粉末约50 mg, 置于1.5 mL离心管中, 加入骨骼专用磁珠法DNA提取试剂盒的裂解液350μ L、蛋白酶K(20 mg/mL)20μ L、1mol/L DTT 20μ L(新鲜配制); 2）在56℃恒温金属浴（Eppendorf公司）混匀(750 r/min低转数震荡)并孵育过夜; 3）10 000 g离心10 min, 取上清液用Kingfisher自动化系统提取骨粉DNA, 模板DNA最终洗脱体积20μ L。

1.4.2 H-K法优化比较

选取常规组中同一个体的骨粉和牙粉、疑难组中22年的骨粉（对照）, 按上述H-K方法提取DNA, 并分别设置不同样本量(50、100、150 mg)及不同消化时间(6、18 h), 以选择确定最佳样本量和消化时间。

1.4.3 Freeze-millKingfisher法(FM-K法)

1）取8份已处理好的陈旧骨骼粉末各约5 g, 已处理好的25颗陈旧牙齿粉末各约1.5 g, 于15 mL离心管中加入骨骼专用磁珠法DNA提取试剂盒裂解液5 mL、蛋白酶K (20 mg/mL) 200 μ L、1 mol/L DTT 200 μ L(新鲜配制); 2）56 ℃恒温金属浴（Eppendorf公司）混匀(750 r/min低转数震荡)并孵育过夜; 3）按前量补加DTT和蛋白酶K; 4）再次重复（2）的处理操作; 5）10000 g 离心10 min; 6）取上清液用Kingfisher自动化系统富集所提取的骨粉及牙粉DNA, 模板DNA最终洗脱体积15 μ L。

1.5 STR分型检测

用Identifiler Plus试剂盒进行复合扩增, 反应总体积10 μ L, 其中DNA模板4 μ L。反应条件：95 ℃、11 min; 94 ℃、20 s; 59 ℃、3min; 60 ℃、10 min; 循环数30。PCR产物在3500遗传分析仪上进行毛细管电泳, GeneMapper ID-X V1.4软件对电泳数据做分析。

2 结果
2.1 H-K法提取常规组骨骼、牙齿DNA的结果

H-K法提取DNA结果见表1。由表可见, 保存时间在2年内、不同保存环境的常规组检材采用H-K法提取成功率达到99.42 %（成功获得15个STR分型结果）。

表1 H-K法提取DNA结果 Table 1 DNA Extracted by H-K processing
2.2 H-K法优化后提取DNA的结果

按本文1.4.2项选取检材以及同样的条件与操作进行分组并检验, 所得 STR分型结果见表2。可见, 随着消化时间的延长和消化骨粉、牙粉量的增加, STR检验的成功率也在增加。因此, 对于常规的骨骼、牙齿检材, 选用100 mg骨粉或牙粉量、消化时间18 h, 就可基本上成功获得STR分型结果。但对于22年的陈旧检材, H-K法检测成功率为0, 全部检测失败。

表2 H-K法在不同优化条件下提取DNA结果比较 Table 2 Comparison of DNA extracted by H-K processing under different optimal conditions
2.3 FM-K法提取疑难组骨骼牙齿DNA的结果

FM-K法提取DNA结果见表3。疑难组骨骼和牙齿样本采用FM-K法提取成功率达到96.97 %（成功获得12个STR结果以上, 具备比对条件）和90.91 %（成功获得15个STR分型结果）。

表3 FM-K法提取DNA结果 Table 3 DNA Extracted by FM-K processing
2.4 案例应用

2010年12月, 榆林某地发生一起配阴婚盗尸案, 嫌疑人盗取埋在地底下46年的一具女性遗骸。遗骸追回后, 需做DNA进行亲缘关系比对。采用本文1.4.3FM-K法提取DNA, 成功获得了STR分型结果(图1), 为尸源认定提供了重要依据。

图1 46年陈旧骨骼STR分型结果Fig.1 STR typing from a 46-year bone

1993年5月29日, 在蒲城县某一小煤窑井口附近, 南某因开煤窑的琐事与王某发生争执而被打伤, 后死亡, 王某在逃。2015年8月18日, 王某归案, 需确定22年前受害人南某的身份, 开棺提取胫骨一份, 采用本文1.4.3FM-K法提取DNA, 成功获得了STR分型结果(图2)。

图2 22年陈旧骨骼STR分型结果Fig.2 STR typing from a 22-year bone

3 讨论

目前, 骨骼、牙齿DNA检验已成为法医DNA检验鉴定的常规技术[5], 采用脱钙法等传统手段检验, 虽然对较为新鲜的骨骼、牙齿成功率能达到97.92 %（96例检材中94例成功）[6, 7], 但对于陈旧的骨骼、牙齿成功率却相对较低, 且存在耗时长、所用有机试剂毒性大、出峰不均衡等缺点[8]。本文利用Handy-Eco仪器和冷冻研磨仪研磨骨骼、牙齿, 结合Kingfisher自动化提取设备和骨骼专用磁珠法DNA提取试剂盒, 使骨骼和牙齿的DNA提取成功率达到99.42 %（常规骨骼牙齿类）和96.97 %（疑难骨骼牙齿类）。

笔者认为, 对日常检案中遇到的大部分常规类型骨骼、牙齿检材, 由于通常其保存时间不超过2年, 保存环境也相对较好, 这类检材可用H-K法处理, 消化需要的骨粉、牙粉量少, 省时省力, STR检出成功率也很高。另外, H-K法所用Handy-Eco仪器与普通电钻相比, 还具有以下优点：一是Handy-Eco打磨工具功率相对较低, 转速相对较慢, 故震动频率就相对较低, 摩擦力较小, 不易产生过量热能; 二是Handy-Eco打磨工具易控制转速, 操作简单, 稳定性好, 便于单手掌握; 三是Handy-Eco打磨工具的转头小巧轻便, 易更换, 一物证一转头, 能防污染, 经济成本低; 四是经过Handy-Eco打磨工具处理过的骨粉或者牙粉比较细腻, 有利于下一步的消化。

本文所有检材均来自于日常检案, 故所讨论的H-K法也是因工作实际需要而建立, 后来逐步优化。对于常规骨骼检材, 取材量50 mg和消化6 h的条件并不能获得理想的STR分型结果, 但适当增加取材量（100 mg）及延长消化时间（18 h, 低转数震荡过夜）后, 便可有效提高提取成功率。当然, 取材时需选用完整性相对较好的骨松质和骨密质。对于牙齿检材, 磨牙粉时需磨到牙髓处。另外, 在DNA扩增阶段适当增加PCR循环数, 也可提高扩增成功率[2]。

对于疑难骨骼、牙齿检材, 比如时间过久, 保存环境恶劣, 检材量非常少的情况, 使用H-K法的成功率基本上为零（见表2）, 此时可考虑直接选用FM-K法, 因为：1）在超低温环境下打磨骨骼、牙齿, 有利于最大程度地保护其中的DNA; 2）消化时骨粉用量比较大, 其中的骨细胞含量相对增加, 在一定程度上提高了检测成功率; 3）FM-K法与传统脱钙法相比, 提取时间短, 操作步骤少, 实验周期紧凑, 自动化程度高, 污染风险也低[9]; 4）Kingfisher自动化提取系统能将大量的裂解液进行富集, 且最小洗脱体积仍可达到15 μ L, 获得的DNA浓度和纯度均较高。

综上所述, 本文提取骨骼牙齿DNA的方法, 操作步骤简单, 使用常规试剂, 成本低, 成功率高, 适于基层法医对陈旧骨骼、牙齿中的DNA进行检验。

The authors have declared that no competing interests exist.

作者已声明无竞争性利益关系。

参考文献
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