引用本文
顾丽华, 杨帆, 梅兴林, 周怀谷. 15个常染色体和18个Y染色体STR基因座复合扩增检测体系及法医学应用[J].刑事技术, 2018,43(1):30-34
GU Lihua, YANG Fan, MEI Xinglin, ZHOU Huaigu. Research and Development of a Forensic Multiplex STR Kit Containing 15 Autosomal and 18 Y STR Loci[J]. Forensic Science and Technology,2018,43(1): 30-34  
doi: 10.16467/j.1008-3650.2018.01.006
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《刑事技术》编辑部
15个常染色体和18个Y染色体STR基因座复合扩增检测体系及法医学应用
顾丽华1, 杨帆1, 梅兴林2, 周怀谷1,*
1.上海市公安局物证鉴定中心,法医物证学现场应用技术公安部重点实验室,上海市现场物证重点实验室,上海200083
2. 无锡中德美联生物技术有限公司,江苏 无锡214174
* 通讯作者：周怀谷（1960—）,男,浙江绍兴人,主任法医师,博士,研究方向为法医DNA分析技术。E-mail:hgzhou803@hotmail.com

第一作者简介：顾丽华（1967—）,女,浙江海盐人,主任法医师,硕士,研究方向为法医DNA分析技术。E-mail:crislh@sina.com

基金资助: 上海市科研计划项目（No.13JG0500200）
摘要

目的 建立15个常染色体和18个Y染色体STR基因座以及性别基因座的六色荧光标记复合PCR直扩检测体系,并评估其法医学应用价值。方法 采用六色荧光标记技术,建立15个常染色体STR基因座 (D3S1358、D13S317、D7S820、D16S539、TPOX、TH01、D2S1338、CSF1PO、D19S433、vWA、D21S11、D18S51、D8S1179、D5S818、FGA) 和18个Y染色体STR基因座 (DYS527a/b、DYS448、DYS456、DYS385a/b、DYS458、DYS391、DYS390、DYS19、DYS438、DYS393、DYS389Ⅰ、DYS439、DYS389Ⅱ、DYS392、GATA、DYS635) 以及Amelogenin的复合扩增体系,收集800份无关人员血样进行基因座检测,评估所建复合扩增体系的稳定性、灵敏度、种属特异性、直扩可行性以及抗抑制性。结果 本检测体系对800份无关人员血样复合扩增后,结果准确,灵敏度达0.125ng;种属特异性高;38份案件检材全部准确分型。在对照男性与女性的DNA浓度比值大于等于1：4时,男性DNA的所有基因座均能准确分型。若模板DNA中含一定浓度的已知抑制剂时,所有基因座也均准确分型。结论 本文建立的复合扩增检测体系可同时检测15个常染色体和18个Y染色体基因座以及性别基因座,结果稳定准确,灵敏度高,可为法医DNA检测分析提供一个新选择。

关键词: STR; 复合PCR; 直扩体系; 六色荧光标记; 法医遗传学
中图分类号:DF795.2 文献标志码:A 文章编号:1008-3650(2018)01-0030-05
Research and Development of a Forensic Multiplex STR Kit Containing 15 Autosomal and 18 Y STR Loci
GU Lihua1, YANG Fan1, MEI Xinglin2, ZHOU Huaigu1,*
1. Shanghai Key Laboratory of Crime Scene Evidence & Ministry of Public Security’s Key Laboratory of Forensic Evidence and Scene Technology, Institute of Forensic Science of Shanghai Public Security Bureau, Shanghai 200083, China;
2. AGCU Scien-Tech Incorporation, Wuxi 214174, Jiangsu, China
Abstract

Objective To develop a 6-dye fluorescence-labelling PCR multiplex protocol that directly amplifies 15 autosomal and 18 Y STR loci plus one Amelogenin gender indicator without DNA extraction, and evaluate its forensic applicability.Methods With 800 DNA samples of inter-irrelevant individuals, the developed protocol was tested by the samples to be amplified locally at the 15 autosomal (D3S1358, D13S317, D7S820, D16S539, TPOX, TH01, D2S1338, CSF1PO, D19S433, vWA, D21S11, D18S51, D8S1179, D5S818, FGA) and 18 Y STR loci (DYS527a/b, DYS448, DYS456, DYS385a/b, DYS458, DYS391, DYS390, DYS19, DYS438, DYS393, DYS389Ⅰ, DYS439, DYS389Ⅱ, DYS392, GATA, DYS635) plus the gender marker Amelogenin. The protocol was evaluated on its stability, sensitivity, species specificity, viability and anti-inhibition.Results All the selected-34-locus STR profiles were accurately and steadily amplified from the 800 samples by the developed protocol, with the high species specificity to be met and the detectable minimal DNA amount equal to or over 0.125ng. The 38 samples from real cases were correctly exposed of their genotypes. All the male STR loci had been exactly revealed when the control DNA was mixed with that of male and female in a ratio at or over 1: 4. Moreover, the anti-inhibition assay demonstrated that all the STR loci can be shown if the DNA template contains at or below certain concentrations of given PCR-inhibitors.Conclusion The developed protocol can be used to amplify the designed 15 autosomal and 18 Y STR loci plus the sex-typing marker Amelogenin with high portability, stability and sensitivity, capable of providing a new way for forensic DNA analysis.

Key words: STR; multiplex PCR; direct amplification; 6-dye fluorescence-labelling; forensic applicability

司法鉴定中, 常染色体和Y染色体的STR基因座检测已成为常规手段。Y染色体呈父系、单倍型遗传, 故在父系亲缘鉴定中有重要作用。在一些父系家族的亲权鉴定、混合斑男性成分的检测、不同男性个体混合物的分析等当中, 联合应用常染色体及Y染色体的STR分型技术会起到关键作用[1, 2, 3, 4, 5, 6]。为减轻工作量、节约成本、缩短检测时间, 进一步满足司法鉴定需求, 15个常染色体与18个Y染色体STR基因座以及性别基因座的复合检测体系被建立, 本文对此报道并评价其法医学应用价值。

1 材料与方法
1.1 样品

本实验室法庭科学DNA数据库建库的无关个体血样800份, 其中400份用Chelex-100提取, 另400份用于直接扩增（取样直径 1 mm）。购自农贸市场的猪、牛、羊、鸡、鸭、鱼血用于种属特异性检测。标准DNA：9947A (女性DNA), 9948 (男性DNA)。混合样品：9948与9947A混合比为1：1、1：2、1：4、1：9、1：19。刑事案件检材38份, 其中血斑8份, 烟蒂21份, 肋软骨5份, 精斑4份。含抑制剂（血红素、血红蛋白和腐殖酸）的模板DNA。

1.2 主要仪器及试剂

自动提取工作站 (瑞士TECAN公司), DB-100A全自动打孔机, 美国AB公司的9700型PCR扩增仪与3500遗传分析仪。美国AB公司的Sinofiler试剂盒、Identifiler-plus试剂盒和Y-filer试剂盒, 以及无锡中德美联生物技术有限公司的AGCU Y-24试剂盒。

1.3 复合扩增体系的建立

1.3.1 基因座的选择

选定国内外行业通用的Identifiler-plus的所有基因座和Y-filer中的16个基因座（减去DYS437）, 增加AGCU Y-24试剂盒中的DYS527基因座（见表1）。

表1 15个常染色体和18个Y染色体的STR基因座复合直扩体系中各基因座 Table 1 Information of 15 autosomal and 18 Y STR loci in the multiplex PCR direct amplification kit

1.3.2 引物的设计和合成

根据引物系统的灵敏度、均衡性、适用性要求, 试剂盒采用六色荧光：第一组D3S1358、D13S317、D7S820、D16S539、DYS527、DYS448, 引物用FAM标记; 第二组DYS456、TPOX、TH01、D2S1338、CSF1PO、DYS385、DYS458, 引物用HEX标记; 第三组DYS391、D19S433、vWA、D21S11、D18S51、DYS390, 引物采用TAMRA标记; 第四组Amel、D8S1179、D5S818、DYS19、FGA、DYS438, 引物用ROX标记; 第五组DYS393、DYS389Ⅰ 、DYS439、DYS389Ⅱ 、DYS392、GATA_H4、DYS635, 引物用VIG标记; 第六组是内标, 用SIZ标记。

1.3.3 复合扩增体系的建立和优化

PCR扩增体系为20 μ L, 含PCR反应液8.0 μ L、引物液0.6 μ L、热启动Taq酶0.6 μ L、模板DNA液10.8 μ L (含H2O) 。

扩增程序：95℃× 11 min, 94℃× 45 s, 55℃× 1 min, 72℃× 1 min, 33个循环, 60℃× 60 min, 4℃保温。

1.3.4 PCR产物的检测

采用ABI3500型遗传分析仪及 Gene Mapper ID-X软件对PCR产物进行检测和分型。

1.4 检测体系性能指标验证

1.4.1 批量样本测试和直扩批量样本测试

取400份Chelex-100法提取的建库血样, 进行PCR扩增和DNA分型检测。取400份建库血样, 打孔直径1 mm, 进行直接PCR扩增和DNA分型检测。与Sinofiler试剂盒、Identifiler-plus试剂盒和Y-filer试剂盒以及AGCU Y-24试剂盒进行一致性和成功率比较。

1.4.2 灵敏度检测

取9948 (男性DNA)标准对照, 分别以1.0、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.031 ng的模板量, 进行PCR扩增和DNA分型检测, 每种浓度进行两次平行实验。

1.4.3 混合样本检测

取9948 (男性DNA)和9947A (女性DNA)标准品, 按两者浓度比1：1, 1：2, 1：4, 1：9, 1：19的比例混合, 进行PCR扩增和DNA分型检测, 每种混合比浓度进行两次平行实验。

1.4.4 种属特异性检测

取购自农贸市场的猪、牛、羊、鸡、鸭、鱼的血, 进行PCR扩增和DNA分型检测。

1.4.5 案件生物检材检测

取日常刑事案件检材 38份, 其中血斑8份, 烟蒂21份, 肋软骨5份, 精斑4份, 进行PCR扩增和DNA分型检测。

1.4.6 对不同种类和浓度抑制剂的耐受检测

取分别含有不同浓度的血红素、血红蛋白、腐殖酸等抑制剂的模板DNA, 进行PCR扩增和DNA分型检测。

2 结果

400份血样经Chelex-100法提取后, PCR扩增、检测, 结果稳定, 图谱清晰完整（图1）, 与Sinofiler试剂盒、Identifiler-plus试剂盒和Y-filer试剂盒以及AGCU Y-24试剂盒中相对应基因座的DNA分型结果完全一致, 具有良好的准确性和一致性。另400份血样免提取、直接打孔扩增后, 检测效果与Chelex-100法提取的相同（图2, 其中DYS527 a/b和DYS385 a/b基因座有两个峰）。

DNA9948对照品, 以浓度1.0、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.031 ng的模板量扩增, 结果显示：当DNA模板浓度大于等于0.125 ng时, 所有基因座均能明确分型（图3、4）, 分型结果准确、清晰; 模板浓度为0.0625 ng时, 有2个STR基因座和1个Y基因座未测出; 模板浓度为0.0312 ng时, 有8个STR基因座和3个Y基因座未显示。

对照DNA9948与9947A的浓度比值大于等于1：4时, 男性DNA的常染色体和Y染色体基因座均能明确分型（图5）; 但对照DNA9948与9947A的浓度比值小于1：4, 比如1：9时, 男性DNA部分基因座可检出, 当1：19时, 男性DNA基因座未检出。

图1 Chelex法提取的无关个体血样检测结果图谱Fig.1 Exampled STR genotyping profile of Chelex-extracted DNA from one of 400 unrelated individuals

图2 直扩法提取的无关个体血样检测结果图谱Fig.2 Exampled STR genotyping profile by direct amplification of one blood sample from another 400 unrelated individuals

图3 模板DNA浓度分别为1.0、0.5、0.25、0.125ng的检测结果Fig.3 STR genotyping profiles of the control DNA 9948 at the template concentrations of 1.0, 0.5, 0.25 and 0.125ng

图4 模板DNA浓度为0.125ng的检测结果Fig.4 STR genotyping profile of the control DNA 9948 at the template concentration of 0.125ng

图5 DNA9948与9947A的浓度比值大于等于1：4的混合DNA的检测结果Fig.5 STR genotyping profiles from the mixture of DNA controls 9948 and 9947A at the ratios equal to or over 1:4

农贸市场的猪、牛、羊、鸡、鸭、鱼血, 经PCR扩增后, 在分析范围内, 没有检出DNA分型。38份不同类型案件检材用各自常规方法提取后, PCR扩增、检测, 结果稳定, 图谱清晰完整, 与Sinofiler试剂盒、Identifiler-plus试剂盒和Y-filer试剂盒以及AGCU Y-24试剂盒中相对应基因座的DNA分型结果完全一致, 具有良好的准确性和一致性。当模板DNA中含抑制剂血红素浓度为100 μ mol／L和150 μ mol／L时, 所有基因座均能明确分型; 当模板DNA中抑制剂血红素浓度为200 μ mol／L时, 所有基因座均未检出; 当模板DNA中含抑制剂血红蛋白浓度为500 μ mol／L时, 所有基因座均能明确分型; 当模板DNA中抑制剂血红蛋白浓度为750 μ mol／L时, 有2个STR基因座未检出; 当模板DNA中抑制剂血红蛋白浓度为1000 μ mol／L时, 所有基因座均未检出; 当模板DNA中含抑制剂腐殖酸浓度为5 ng／μ L和10 ng／μ L时, 所有基因座均能明确分型; 当模板DNA中抑制剂腐殖酸浓度为20ng／μ L时, 有2个STR基因座和1个Y基因座未检出。

3 讨论

我国的法庭科学DNA数据库自建立以来已在公安实际检案中发挥了巨大作用。由于罪犯男性居多, 在DNA数据库中增加Y染色体的男性家系遗传特性及其比对功能, 将会进一步扩展DNA数据库的功效。同时, 鉴于中国DNA数据库的规模大, 将常染色体STR和Y-STR的基因座纳入一个试剂盒中, 将能极大节约办案经费, 提升办案效率[7], 有利于快速比对出犯罪嫌疑人, 为侦查破案赢得时间。本检测系统将15个常染色体和18个Y染色体的STR基因座以及性别基因座整合到一起复合扩增, 比董研
报道[8]的体系多了8个Y染色体的STR基因座。其中, DYS385和DYS527因有回文结构, 呈现为两个峰, 有a/b之分, 故它们均按两个基因座计算, 而这也与ladder相一致。常染色体和Y染色体同时检测, 省时、省力, 又满足了微量物证对DNA量无法两次检验的需求, 一次性就能获得尽可能多的遗传信息。由于该体系含有34个基因座, 故采用了六色荧光标记, 从而合理分布各等位基因座检测范围, 避免造成等位基因座检测范围交叉重叠、等位基因丢失与错位等问题的出现, 有利于得到明确、清晰的分型（见图6）。

图6 Ladder中各基因座的分型范围Fig.6 Genotyping range of each genetic locus in the ladder

本试剂盒可采用直扩技术, 能有效缩短整个检测过程时间, 提高整体系统效能。对于直扩的400份无关血样, 单层取样, 直径1 mm。扩增时采用20 μ l体系, 加样1.5 μ l, 检测结果所有基因座峰高均高于2000, 大部分峰高介于6000~8000, 各样品图谱完整清晰。各样品分型与Sinofiler试剂盒、Identifiler-plus试剂盒与Y-filer试剂盒以及AGCU Y-24试剂盒在共有基因座上分型完全一致。直扩技术减少了DNA提取步骤, 既省时省力, 又减少了污染环节[9], 在大规模建库和快速排查嫌疑人的过程中优势明
显。

综上所述, 本文建立的15个常染色体和18个Y染色体的STR基因座以及性别基因座的复合扩增检测体系, 其稳定性、准确性、灵敏度和法医学适用性以及抗抑制性均达到了商品化试剂盒的检测水平, 为法庭科学实践提供了更快速、便捷的新方法, 在刑案侦破、法庭证据、数据库建设以及亲权鉴定方面应都具有更大的应用潜力。

The authors have declared that no competing interests exist.

作者已声明无竞争性利益关系。

参考文献
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