引用本文
王传海, 李湘秦, 吴勇, 徐程, 杜舟. 骨骼及牙齿DNA快速提取方法在DVI中的应用[J].刑事技术, 2017,42(6):512-514
WANG Chuanhai, LI Xiangqin, WU Yong, XU Cheng, DU Zhou. A Method to Extract Rapidly the DNA from Bones and Teeth for Disaster Victim Identification[J]. Forensic Science and Technology,2017,42(6): 512-514  
doi: 10.16467/j.1008-3650.2017.06.018
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骨骼及牙齿DNA快速提取方法在DVI中的应用
王传海, 李湘秦, 吴勇, 徐程*, 杜舟
深圳市公安局刑事科学技术研究所,广东 深圳 518040
* 通讯作者：徐程（1989—）,女,浙江永嘉人,硕士,法医师,研究方向为法医遗传学检验鉴定。E-mail:xucheng19891020@aliyun.com。

第一作者简介：王传海（1973-）,男,安徽合肥人,硕士,副主任法医师,研究方向为法医遗传学检验鉴定。E-mail:boatseawang@126.com。

摘要

目的 探讨骨骼及牙齿DNA快速提取方法在灾难受害者身源鉴定中的应用可行性。方法 将滑坡事故中需鉴定身份的43份骨骼、47份牙齿研磨成粉,以King Fisher Duo Prime微量提取系统提取DNA,仅用约3 h即可对单份骨骼或牙齿完成DNA提取。进行STR分型检验。结果 测试的90份检材均成功获得STR分型。结论 使用King Fisher Duo Prime微量提取系统可以对骨骼及牙齿进行快速DNA提取,适用于灾难受害者的身源鉴定。

关键词: 法医遗传学; 灾难受害者身源鉴定; King Fisher Duo Prime系统; STR分型; 骨骼及牙齿
中图分类号:DF795.2 文献标志码:B 文章编号:1008-3650(2017)06-0512-03
A Method to Extract Rapidly the DNA from Bones and Teeth for Disaster Victim Identification
WANG Chuanhai, LI Xiangqin, WU Yong, XU Cheng*, DU Zhou
Institute of Criminal Science and Technology of Shenzhen Municipal Public Security Bureau, Shenzhen 518040, Guangdong, China
Abstract

Objective To explore the feasibility of a rapid method to extract DNA from bones and/or teeth for disaster victim identification (DVI).Methods Ninety bones and teeth of the victims, died from the Shenzhen “2015.12.20” landslide incident, were grounded into powder, from which the DNA was extracted by King Fisher Duo Prime platform within just about 3 hours and followed to subject to STR genotyping.Results The full-spectrum DNA STR profile was obtained from any one of the 90 samples.Conclusion For DVI, King Fisher Duo Prime platform is eligible for the rapid extraction of DNA from bones and/or teeth.

Key words: forensic genetics; disaster victim identification (DVI); King Fisher Duo Prime platform; STR genotyping; bones and teeth

骨骼、牙齿的STR检验是当前鉴定未知尸骸身份的一种有效手段, 尤其是对灾难受害者的身源鉴定( DVI, disaster victim identification)。故骨骼和牙齿的DNA提取一直是法医DNA检验的重点。目前, 骨骼和牙齿DNA的提取方法包括有机提取法[1]、硅珠法[2]、磁珠法[3]等, 传统的骨骼及牙齿DNA提取方法存在操作过程繁琐、耗时长、试剂毒性大、DNA提取率较低等缺点[4], 因此, 检验人员遇到此类检材时往往有畏惧心理。本研究利用King FisherDuo Prime微量提取系统和配套的骨骼专用磁珠法提取试剂盒, 实现了对骨骼、牙齿DNA的自动化快速提取, 从而使骨骼、牙齿的检验变得简单易行, 为灾难受害者身源鉴定赢得了宝贵的时间。

1 材料与方法
1.1 材料

检材均来自“ 2015.12.20” 深圳光明新区滑坡事故死者, 死亡时间为10~30 d, 共90例, 其中骨骼43例、牙齿47例。

1.2 仪器和试剂

SPEX 6870 冷冻研磨机 （SPEX SamplePrep, 美国）、9700型PCR扩增仪（Thermo Fisher, 美国）、7500型荧光定量PCR仪（Thermo Fisher, 美国）、3500xL遗传分析仪（Thermo Fisher, 美国）、King Fisher Due Prime 微量提取系统（Thermo Fisher, 美国）。

PowerPlex® 21试剂盒（Promega公司, 美国）、Quantifiler Human试剂盒（Thermo Fisher, 美国）、骨骼专用磁珠法DNA提取试剂盒（长春博坤生物科技有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 样本预处理

用手术刀将骨骼表面层及污垢清理干净并锯成小块, 清污牙齿表面, 以5 % (W/V )次氯酸钠溶液浸泡15 min后弃去次氯酸钠溶液, 蒸馏水泡洗3次以除去次氯酸钠, 无水乙醇浸泡15 min去除残余的水份[5], 于通风橱中干燥, 用液氮研磨机将骨片和牙齿磨成骨粉和牙粉备用。

1.3.2 DNA提取

取骨粉或牙粉1 g, 放入1.5 mL离心管中, 加入800 µ L骨孵育液、200 µ L蛋白酶K溶液（10 mg/mL）, 10 μ L DTT溶液(1 mol/L), 涡旋振荡混匀后56℃孵育1 h, 70℃再孵育30 min。温浴后12 000 r/min离心5 min。将离心后的消化产物转移到骨骼专用磁珠法DNA提取试剂反应板中, 在King Fisher Due Prime系统平台上提取DNA, 用40µ L高纯水洗脱回收。

1.3.3 DNA定量

应用Quantifiler Human试剂盒, 对上述洗脱回收后的DNA进行定量检测, 反应体系为：Primer Mix 10.5 µ L, Reaction Mix 12.5 µ L, DNA模板2 µ L, 用7500型荧光定量PCR仪进行检测, 采用HID Real-Time PCR Analysis Software分析数据。

1.3.4 扩增及电泳

扩增试剂选用PowerPlex® 21试剂盒, 扩增体系为：Master Mix 2 µ L, Primer Mix 2 µ L, H2O 5 µ L, DNA模板根据定量结果取0.5~1 µ L。

扩增仪选用9700型PCR扩增仪, 参数为：96℃热启动1 min; 94℃、10 s, 59℃、1 min, 72℃、30 s, 循环29次; 最后60℃、20 min; 4℃ 保存备用。选取PowerPlex® 21试剂盒中2800 M为阳性对照, 纯水作为阴性对照。

取扩增产物1 µ L, 加入10 µ L甲酰胺和内标的混合物（1000:70）, 在 3500 xL遗传分析仪上进行毛细管电泳检测, GeneMapper ID-X软件分析电泳结果, 峰高RFU≥ 200。

2 结果
2.1 DNA定量检测

采用7500型荧光定量PCR仪对43例骨骼、47例牙齿检材进行DNA含量检测, 标准扩增曲线Slope值为-3.169, R2值为0.996, 43例骨骼、47例牙齿DNA平均含量结果分别为（1.5343± 0.3168）ng/µ L、（1.3625± 0.2346））ng/µ L。

2.2 STR分型检测

本研究中以样本获得包括性别及15个以上STR基因座分型的为检出成功。结果显示：43份骨骼与47份牙齿均成功检出, 所有基因座STR分型, 电泳峰清晰, 各基因座之间峰高均衡性好, 同一STR基因座等位基因峰高差小于30 %, 峰宽小于1.5 bp（见图1）。经与失踪人员的亲属样本进行比对, 89例符合遗传关系, 1例与遇难者生前个人物品检出的分型一致。

图1 King Fisher Duo Prime系统提取的1例骨骼STR分型图谱Fig.1 STR profiling of 1 piece of bone extracted by King Fisher Duo Prime platform

3 讨论

骨骼和牙齿是人体最坚硬的结构组织, 能在很大程度上抵抗水分、空气、温度等因素对DNA的破坏, 在高度腐败和白骨化的情况下, 牙齿和骨骼往往是唯一有效的生物检材, 对死者的身份确认非常重要。骨骼由骨细胞、纤维和基质三种成分组成, 有大量的钙盐沉积于细胞间质, 其无机盐成分占骨干重的
65 %~75 %, 主要为羟基磷灰石[Ca10(PO4)6(OH)2]成分。骨骼DNA提取可利用EDTA 的脱钙作用软化骨组织, 结合蛋白酶K和表面活性剂对细胞进行裂解, 从而释放深层骨组织中的DNA, 因此传统的提取方法都依赖长时间的EDTA脱钙处理, 而脱钙会导致DNA含量丢失[6], 在弃去脱钙液的同时, 有一部分DNA也随之流失。实验证明在大多样本中DNA含量的损失在50 %以上, 部分样品的DNA含量损失甚至高达80 %[7]。

本研究使用King Fisher Duo Prime微量提取系统的方法, 检验成功率高达100 %, 具有以下优势：

1）大大缩短了提取时间。该方法使用骨骼专用磁珠法DNA提取试剂盒, 通过强效骨骼孵育液配合蛋白酶K快速破坏骨细胞膜达到释放其中DNA的目的。由于免去了长时间的脱钙过程, 提取骨骼和牙齿DNA的时间大大缩短, 仅需56℃孵育1 h、70℃孵育30 min及King Fisher Duo Prime系统平台保持80 min, 整个过程不到3 h, 而传统的方法一般在12 h以上[8]。

2）自动化程度高。传统的方法往往需要有机法抽提、多次转管、多次离心, 过程复杂且费事费力、不易掌握。而本方法消化完成后的操作过程可以实现自动化提取, 操作便捷, 易学易会, 检验人员可从繁杂的手工机械操作中解脱出来。

3）降低了潜在污染的风险。随着DNA技术的不断进步, DNA检验的灵敏度越来越高, 微量DNA的检出效果日益提高, 但同时, DNA较高的检验灵敏度也是一把双刃剑, 如果不注意检验过程特别是提取环节的污染防范, 结果就会存在风险。传统的骨骼提取方法过程复杂, 使用的试剂、耗材种类较多, 且多是手工操作, 对操作者的技能和责任心要求都很高, 出现外源性和内源性污染的概率相对较大, 而本研究使用的方法自动化程度高, 大大减少了人工干预, 出现污染的概率较小。

4）DNA纯度、浓度高。应用磁珠法提取DNA, 特异性地吸附DNA, 能去除绝大多数的杂质和PCR抑制剂, 因此提取的DNA模板纯度较高; 同时由于没有脱钙的过程, 减少了DNA的损耗, 定量结果显示, 提取DNA的含量在1~2 ng/µ L左右, 足以满足后续的检验。

5）检验成本低。本研究选用的骨骼专用磁珠法DNA提取试剂盒由国内公司研发, 价格只有同类进口产品的1/2, 大大降低了检验成本。

重大灾难事故往往为突发事件, 遇难者人数较多, 社会影响大, 遇难者家属非常希望早日认领遗体, 社会也非常期待快速高效的善后处置工作, 为此以DVI为核心的整个善后工作应当遵循科学、客观、准确、高效的原则。重大灾难事故因参与救援、善后的人员涉及政府各个部门, 公安系统又涉及各个警种, 如果处置不当, 十分容易产生混乱。因此, 在DVI工作中科学合理的处置方案非常重要。从DNA鉴定角度来看, DVI工作主要涉及实验室内外两方面, 实验室外主要指现场、外围工作, 现场方面要加强同负责现场处置的法医、痕迹、影像等专业人员的沟通、联系, 确定尸体或尸块的编号、位置、随身物品, 了解腐败程度, 确定最佳的取材部位; 外围工作主要是遇难者亲属样本和生前样本采集, 要对采集人员进行相关知识的培训, 明确亲属样本和死者生前样本采集的原则和范围, 减少不必要的多次采集, 避免浪费人力物力和无谓的刺激亲属情绪。实验室内工作要做到合理分工、规范操作, 选择快速可靠的DNA检验方法。只有切实做好实验室内外两方面的工作, 才能保证整个DVI工作迅速、准确、高效。本研究方法实现了对骨骼、牙齿DNA的快速、自动化提取, 大大缩短了DVI的时间, 是一项很有实际意义的探索。

本研究选用的检材为“ 2015.12.20” 深圳光明新区滑坡事故遇难者遗骸, 骨骼和牙齿相对较为新鲜, 没有涵盖陈旧性骨骼和牙齿, 故对陈旧性骨骼和牙齿的检验效果仍需今后作进一步研究和探讨。

The authors have declared that no competing interests exist.

作者已声明无竞争性利益关系。

参考文献
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