混有腐植酸600μ g和黑色素200μ g的样本, 经Aurora核酸纯化系统纯化后, 提取的纯化产物颜色由浑浊变为澄清; 而经AutoMateExpress™ 自动化提取仪纯化后, 纯化产物颜色依旧浑浊。用检出等位基因座个数比较AutoMateExpress™ 自动化提取仪和Aurora核酸纯化系统纯化的效果, 发现Aurora核酸纯化系统纯化后, 5个实验样本所有STR基因座的全部等位基因均成功检出; 但经AutoMateExpress™ 自动化提取仪纯化后的5个实验样本所有STR 基因座的全部等位基因均未检出（表1、2）、（图1、2, 分别以1号与2号样本为例）。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 含有600μ g腐植酸模拟DNA样本经SCODA技术和磁珠法纯化后STR基因座检出数 Table 1 The number of STR alleles detected from the simulative 600μ g-humic-acid-containing DNA samples purified by SCODA technology and magnetic beads 纯化方法 样本号 1号 2号 3号 4号 5号 Aurora核酸纯化系统 24 24 24 24 24 AutoMateExpressTM自动化提取仪+ PrepFiler Express BTATM磁珠提取试剂盒 0 0 0 0 0 注：所得分型图谱等位基因RFU值大于100视为检出, RFU值小于等于100视为未检出。

表1 含有600μ g腐植酸模拟DNA样本经SCODA技术和磁珠法纯化后STR基因座检出数 Table 1 The number of STR alleles detected from the simulative 600μ g-humic-acid-containing DNA samples purified by SCODA technology and magnetic beads

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 含有200μ g黑色素模拟DNA样本经SCODA技术和磁珠法纯化后STR基因座检出数 Table 2 The number of STR alleles detected from the simulative 200μ g-melanin-containing DNA samples purified by SCODA technology and magnetic beads 纯化方法 样本号 1号 2号 3号 4号 5号 Aurora核酸纯化系统 24 24 24 24 24 AutoMateExpressTM自动化提取仪+ PrepFiler Express BTATM磁珠提取试剂盒 0 0 0 0 0 注：所得分型图谱等位基因RFU值大于100视为检出, RFU值小于等于100视为未检出。

表2 含有200μ g黑色素模拟DNA样本经SCODA技术和磁珠法纯化后STR基因座检出数 Table 2 The number of STR alleles detected from the simulative 200μ g-melanin-containing DNA samples purified by SCODA technology and magnetic beads

图1

Fig.1

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	图1 含有600μ g腐植酸模拟DNA样本经SCODA技术(左)和磁珠法(右)纯化后分型结果Fig.1 The STR alleles detected from the simulative 600μ g-humic-acid-containing DNA samples purified by SCODA technology (above) and magnetic beads (below)

图2

Fig.2

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	图2 含有200μ g黑色素模拟DNA样本经SCODA技术(左)和磁珠法(右)纯化后分型结果Fig.2 The STR alleles detected from the simulative 200μ g-melanin-containing DNA samples purified by SCODA technology (above) and magnetic beads (below)

法医生物检材常因DNA含量低、品质差、含抑制物等原因而导致其难以获得完整的STR分型, 随着商品化扩增试剂盒检测灵敏度的不断提高和mini-STR、Indel、SNP、mtDNA等分析方法对降解检材的要求趋低, 能否去除检材中的抑制物成为法医DNA检验成功的关键。常见的抑制物如血液中的血红素、头发中的黑色素、骨骼中的胶原蛋白和钙磷酸盐、食物中的单宁和牛仔布料中的靛蓝染料等均可导致PCR扩增失败^[2]。腐植酸是自然界中广泛存在的大分子有机物质, 由死亡生物的物质（如木质素）经微生物降解产生, 腐殖酸因其对聚合酶有非竞争性抑制作用而能降低DNA聚合酶的最大反应速度^[3]。从土壤和天然水源中提取的生物检材常会被腐殖酸污染^[4]。Faber实验研究表明腐殖酸和黑色素对PCR反应的抑制是通过捆绑结合DNA分子而阻碍引物与DNA链结合, 从而使模板DNA分子减少^[5]。目前, 常用的去除生物检材中抑制物的方法有磁珠法、Chelex法、有机法等。硅膜过滤柱也可以纯化DNA , 但对某些抑制剂不能有效去除, 而增加纯化步骤又会导致样本损耗。此外, 稀释DNA样本、在扩增体系中添加牛血清白蛋白（BSA）和额外的Taq酶^[6]也可降低抑制物对DNA分型结果的影响。胡清清等的实验研究表明国产博坤磁珠试剂盒可有效去除DNA样本中较低浓度的腐植酸、黑色素、胆汁酸盐、胶原质、血红素、尿素, 而Wawasye磁珠试剂盒对黑色素和腐植酸的去除效果欠佳^[7]。

SCODA是近年出现的一种DNA纯化新技术, 该技术通过琼脂糖电泳分离抑制物和DNA分子, 从而达到纯化DNA的目的。DNA分子因其复杂的超螺旋结构和高电荷密度, 使之在电场作用下易于通过凝胶筛, 故通过实验设计可使DNA分子因电场力而构象改变并在电场中移动, 而其他带电分子则保持静止, 因此而与杂质相分离。SCODA技术是利用旋转电场, 将DNA分子移动至凝胶中心, 电场中心不再设置电极, 以此既避免了对DNA分子的化学损伤, 又达到了与抑制物分离的目的。Broemeling^[8]实验研究表明SCODA技术对DNA分子具高选择性筛选作用, 可以将DNA浓度提升10 000倍, 并且纯化后的溶液检测不到腐殖酸等PCR抑制物。Sarah^[9]用AmpFLSTR^® Identifiler^® PCR Amplification Kit（美国ThermoFisher公司）检测纯化后残留抑制物的影响, 发现经SCODA技术纯化后的DNA可以检出完整分型, 但是用QIAquick^® PCR Purification（德国QIAGEN公司）纯化时, 200 μ g及以上的黑色素、1 mg的腐植酸均会使STR分型不能检出, 而600 μ g腐植酸则就会使部分基因座丢失。在所有检出的STR有效分型中, 经SCODA纯化的RFU为4183~6877, 而经QIAquick^® PCR Purification（德国QIAGEN公司）纯化的RFU为873~4155。Aurora核酸纯化系统是基于SCODA技术设计而成, 适用于含有物理性抑制物的法医生物检材, 一次处理样本量可达5 mL, 可通过样本室的多次进样实现大体积样本的浓缩纯化, 不足之处是该仪器一次运行仅能纯化一个样本且实验时间较长。

本实验中, 用GlobalFiler^® PCR Amplification Kit检测纯化后的产物, 用检出STR等位基因个数比较SCODA技术和磁珠法纯化的效果。经基于SCODA技术的Aurora核酸纯化系统纯化后的模拟样本（含有黑色素200 μ g、腐植酸600 μ g）均可检出完整分型, 但用基于磁珠法的AutoMateExpress™ 自动化提取仪纯化, 同样条件处理的模拟样本却均未检出完整STR分型。因此, 当现场检材中混有较大剂量的黑色素或腐植酸时, SCODA技术去除抑制物的能力优于传统的磁珠法。