引用本文
王瑞花, 栾玉静, 刘瑞, 董颖, 杜鸿雁, 常靖. GC/MS法测定全血中的甲苯噻嗪[J].刑事技术, 2017,42(5):389-391
WANG Ruihua, LUAN Yujing, LIU Rui, DONG Ying, DU Hongyan, CHANG Jing. Determination of Xylazine in Human Whole Blood by GC/MS[J]. Forensic Science and Technology,2017,42(5): 389-391  
doi: 10.16467/j.1008-3650.2017.05.011
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GC/MS法测定全血中的甲苯噻嗪
王瑞花1, 栾玉静1,*, 刘瑞2, 董颖1, 杜鸿雁1, 常靖1
1.公安部物证鉴定中心,北京 100038
2.河北省公安厅,石家庄 050092
* 通讯作者：栾玉静（1979—）,女,山东龙口人,博士,副研究员,研究方向为毒物分析。E-mail:18836705@qq.com

第一作者简介：王瑞花（1978—）,女,山西运城人,硕士,副研究员,研究方向为毒物分析。E-mail:nqkczs@126.com

基金资助: 中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金项目（No.2013JBYY001）
摘要

目的 建立全血中甲苯噻嗪的固相萃取/气相色谱质谱检测方法。方法 血液样品用4倍体积的pH=6的磷酸缓冲盐稀释,离心,上清液经Oasis HLB固相萃取柱提取净化,GC/MS法进行定性定量分析,选用碎片离子 m/ z220做定量离子。结果 甲苯噻嗪在0.50~50.0μg/mL浓度范围内线性关系良好（ r2=0.991）,检出限为23.7ng/mL,在0.50μg/mL添加水平,回收率大于65.0%,方法日内RSD<6.37%,日间RSD<8.34%。结论 本方法简单快速,选择性好,可用于实际案件中甲苯噻嗪的检测。

关键词: 毒物分析; 甲苯噻嗪; 固相萃取; 气相色谱质谱法
中图分类号:DF795.1 文献标志码:A 文章编号:1008-3650(2017)05-0389-03
Determination of Xylazine in Human Whole Blood by GC/MS
WANG Ruihua1, LUAN Yujing1,*, LIU Rui2, DONG Ying1, DU Hongyan1, CHANG Jing1
1. Institute of Forensic Science, Ministry of Public Security, Beijing 100038, China
2. Hebei Provincial Public Security Bureau, Shijiangzhuang 050092, China
Abstract

Objective To develop a method for determining xylazine in human whole blood by solid phase extraction/gas chromatography-mass spectrometry (GC/MS).Methods Blood sample was extracted and purified by Oasis HLB solid phase extraction column after four-fold dilution with phosphate buffer (pH=6), then followed to be analyzed by GC/MS. The ions (m/z 220) were applied for quantitative analysis.Results The limit of detection was 23.7ng/mL and the linear ranges were from 0.50μg/mL to 50.0μg/mL ( r2=0.991). The average recoveries for xylazine were over 65.0% in the blood sample spiked with the drug’s concentration at 0.50μg/mL, and the relative standard deviations (RSD%) were less than 6.37% for intra-day and 8.34% for inter-day determination.Conclusion The method is simple, suitable for the determination and confirmation of xylazine in blood sample.

Key words: toxicological analysis; xylazine; solid phase extraction; gas chromatography-mass spectrometry

甲苯噻嗪（xylazine, C12H16N2S）又名甲苄噻嗪、赛拉嗪, 是一种广泛使用的兽用镇静止痛剂, 该化合物通过作用于α 2 受体和外周神经, 起到局部麻醉和肌肉松弛作用[1]。该药对人的麻醉作用迅速, 肌肉注射15~20 min、静脉注射1~2 min产生作用, 药效可持续4 h以上。用以绑架、麻醉强奸、抢劫的案件在国内外均有发生。甲苯噻嗪在体内吸收、代谢、分解快, 仅有约8 %的原体从尿液排出, 口服10~15 h后几乎排泄完全。其在血液中原型物较少, 且难以提取净化, 易被漏检。因此建立血液中甲苯噻嗪的快速、简便准确的检验方法对相关案件的检验至关重要。

国际对甲苯噻嗪研究较多[2, 3], 国内对甲苯噻嗪检验方法的报道较少[4], 未见固相萃取结合气相色谱质谱检测方法。本文研究建立的固相萃取/气相色谱质谱检测方法简便快速、准确可靠, 适用于实际案件血液中甲苯噻嗪的检测。

1 材料与方法
1.1 仪器和试剂

Shimadzu QP 2010 Plus GC/MS, 配有AOC-20i自动进样器; 电子天平（德国Sartorius公司）; Scientific Industries 旋涡振荡器（USA）; 高速离心机（PRIMO 德国）。

甲苯噻嗪标准品购于Sigma公司; 磷酸盐、盐酸、浓氨水及其他有机溶剂均为分析纯试剂; Oasi s MCX(60 mg , 3 cc)和Oasis HLB(60 mg , 3 cc), 均购自Waters公司。

1.2 标准溶液的配制

精确称取甲苯噻嗪标准品10.0 mg于10 mL的容量瓶中, 用甲醇定容, 配置成浓度为1.0 mg/mL的标准储备液, 在4 ℃冰箱中保存, 临用前用甲醇稀释成0.50、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0 µ g/mL的系列浓度标准工作液。

1.3 样品的制备

取血液样品2.0 mL, 加入8 mL pH=6的磷酸缓冲液, 振荡、离心（8000 r/min, 20 min）, 上清液过经甲醇活化、水及pH=6的磷酸缓冲液润洗过的Oasis H LB固相萃取柱, 5 %的甲醇/水淋洗, 弃去淋洗液, 离心甩干萃取柱, 3 mL二氯甲烷洗脱, 收集洗脱液, 50 ℃空气流下挥干, 100 μ L甲醇定容, 供GC/MS分析。

1.4 色谱质谱条件

色谱条件：色谱柱：DB-5MS弹性石英毛细管柱（30 m× 0.25 mm× 0.25 μ m）; 程序升温：100 ℃起始, 保持3 min, 以30 ℃/min升至280 ℃, 保持17 min; 进样口温度280 ℃; 载气：He; 流速：1 mL/min; 分流比：5:1; 进样量1 μ L。

质谱条件：传输线温度200 ℃; 离子源温度230 ℃; 离子源：EI, 电子轰击能量70 eV; 扫描方式：SCAN; 扫描范围：40~450 amu; 溶剂延迟时间：3 min。

2 结果与讨论
2.1 专属性

全血经固相萃取后进行GC/MS检测, 结果甲苯噻嗪色谱峰峰型良好, 保留时间为8.65 min, 特征离子为m/z 205、220。图1、图2为空白血、添加血样在1.4条件下分析的总离子流图（TIC）。图3为甲苯噻嗪特征离子m/z 220提取离子流图, 从图中可看出样品提取物干净, 内源性杂质干扰少, 目标物色谱峰峰型良好, 表明该方法具有良好的专属性。图4为甲苯噻嗪的质谱图, 定量离子为m/z 220, 该质谱图与NIST谱库中甲苯噻嗪质谱图一致 。

图1 空白血的总离子流图Fig.1 Chromatogram of blank blood

图2 添加标准品0.5μ g/mL血样的总离子流图Fig.2 Chromatogram of xylazine (0.5μ g/mL) in sample blood

图3 m/z 220 提取离子流图Fig.3 Chromatogram (m/z 220) of xylazine in sample blood

图4 甲苯噻嗪质谱图Fig.4 Mass spectra of xylazine

2.2 线性范围和检出限

准确移取血样1.0 mL, 分别加入适量的甲苯噻嗪系列浓度标准工作液, 使其在血液样品中的浓度分别为0.5、1.0、2.0、10、50、100 μ g/mL, 依1.3及1.4项下方法操作, 以血液样品中甲苯噻嗪的浓度为横坐标, 以各样品中定量离子（m/z 220）的峰面积为纵坐标, 进行线性回归, 得到血液样本中的回归方程为y= 12190x - 96744（r2=0.991）, 结果表明血液中甲苯噻嗪在0.5~50 μ g/mL范围内线性关系良好。按信噪比（S/N=3）确定最低检出限, 信噪比（S/N=10）确定最低定量限, 测得血中甲苯噻嗪的检出限为23.7 ng/mL, 定量限为79.0 ng/mL。

2.3 回收率和精密度

取空白血液1 mL, 按照2.2方法配制甲苯噻嗪高、中、低3个浓度（1.0、5.0、20.0 μ g/mL）的血液样, 每一浓度平行3份, 按照1.3和1.4项下的方法操作, 每个浓度同日内连续测定3次, 根据目标物特征离子峰面积计算回收率及日内精密度, 连续测定3 d, 计算日间精密度, 结果见表1。

表1 血液样本中甲苯噻嗪的回收率及精密度（n=3） Table 1 Precision and recovery of xylazine in blood samples (n=3)
2.4 固相萃取条件的选择

2.4.1 固相萃取柱的选择

笔者在实验中比较了Oasis HLB和Oasis MCX两种柱子, HLB填料基质是聚合物, 其作用和效果类似于C18固相萃取柱, 但重现性较C18好, 其适用范围广。MCX为阳离子交换柱, 适用于碱性化合物的萃取。甲苯噻嗪为偏碱性药物, 这两种柱子均适宜, 但经试验发现MCX的洗脱溶剂为5 %氨水/甲醇效果好, HLB用二氯甲烷或乙酸乙酯效果比较理想, 考虑到浓缩时二氯甲烷或乙酸乙酯均较5 %氨水/甲醇易挥发, 因此本实验选用HLB做萃取小柱子。

2.4.2 pH值的选择

血液分别用去离子水、0.1 mol/L HCl、pH=6的磷酸缓冲液稀释, HLB固相萃取柱萃取后进行比较, 结果表明血液用pH=6的磷酸缓冲液稀释后效果明显优于其它两种稀释剂。

2.4.3 洗脱液的选择

笔者比较了甲醇、乙酸乙酯、二氯甲烷、乙醚等不同洗脱液的洗脱效果, 结果显示甲醇和乙醚的回收率低, 在1 μ g/mL的添加水平上（n=5）乙酸乙酯达60 %, 二氯甲烷回收率大于73 %, 因此本实验采用二氯甲烷做洗脱溶剂。

2.5 案例应用

某年9月10日, 某省某市陈某家人报案称, 陈某于三天前失踪, 9月15日在田地里发现陈某尸体, 经调查陈某被王某注射不明液体, 昏迷后, 埋于自家田地里, 送检检材为注射器、胃组织及肝组织。GC/MS从注射器中检出甲苯噻嗪, 采用本文方法从胃及肝组织中均检出甲苯噻嗪。

3 结论

本文建立的固相萃取气相色谱质谱检测血液样本中甲苯噻嗪的方法简便快速、灵敏度高、重现性好, 结果准确可靠, 适用于实际案件中甲苯噻嗪的检测。由于甲苯噻嗪在体内代谢快且代谢完全, 因此在实际案件中要及时提取检材, 以免造成漏检, 本文所引用案例, 未取到血液, 仅取到肝及胃组织, 结果证明本方法也适用于胃、肝等脏器组织。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
[1] 王泽民, 康葵, 冯梅, 等. 当代结构药物全集[M]. 北京: 北京科学技术出版社, 1993. [本文引用:1]
[2] DORAN G S, BRADBURY L A. Quantitation of the anaesthetic xylazine in ovine plasma by LC-MS/MS[J]. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci, 2015, 997: 81-84. [本文引用:1]
[3] SPYRIDAKI M H, LYRIS E, GEORGOULAKIS I. Determination of xylazine and its metabolites by GC-MS in equine urine for doping analysis[J]. J Pharm Biomed Anal, 2004 , 35: 107-116. [本文引用:1]
[4] 高雪, 盖薇, 顾朝康. 超高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱法测定血液与尿液中的赛拉嗪及代谢物2, 6-二甲基苯胺[J]. 分析测试学报. 2015, 34: 646-651. [本文引用:1]