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康伟, 周拓, 陈愉, 贺纪明, 刘俊, 吴开封. HPLC/MS/MS同时检测血中啶虫脒和哒螨灵[J].刑事技术, 2017,42(5):379-381
KANG Wei, ZHOU Tuo, CHEN Yu, HE Jiming, LIU Jun, WU Kaifeng. Simultaneous Determination of Acetamiprid and Pyridaben in Blood Samples by HPLC/MS/MS[J]. Forensic Science and Technology,2017,42(5): 379-381  
doi: 10.16467/j.1008-3650.2017.05.008
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HPLC/MS/MS同时检测血中啶虫脒和哒螨灵
康伟, 周拓, 陈愉, 贺纪明, 刘俊, 吴开封
宁波市公安司法鉴定中心,浙江 宁波315000

第一作者简介：康伟（1982—）,男,安徽铜陵人,学士,工程师,研究方向为毒物分析。E-mail:kw021107@163.com

摘要

目的 建立血液中啶虫脒和哒螨灵的液相色谱-串联质谱的检测方法。方法 取0.5 mL血用1.0 mL乙腈沉淀蛋白,选用Kinetex®2.6μm C18 100mm×2.1mm色谱柱,以乙腈（A相）和20mM乙酸铵+0.1%甲酸（B相）作为流动相进行梯度洗脱分离,采用液相色谱-串联质谱仪的电喷雾电离,正离子模式扫描,多反应监测模式（MRM）检测啶虫脒和哒螨灵,并用外标法定量。结果 该方法可有效分离血中啶虫脒和哒螨灵,保留时间分别为1.06min和2.74min。血中啶虫脒和哒螨灵在0.5~100ng/mL范围内线性良好,回归方程分别为 y=52753 x+1024和 y=98780 x+3466,定量限为0.5ng/mL。啶虫脒和哒螨灵的回收率均在70%以上,精密度均小于10%。结论 本文所建立方法简便、快速、有效,适用于血中啶虫脒和哒螨灵定性定量检测。

关键词: 啶虫脒; 哒螨灵; 液相色谱-串联质谱
中图分类号:DF795.1 文献标志码:A 文章编号:1008-3650(2017)05-0379-03
Simultaneous Determination of Acetamiprid and Pyridaben in Blood Samples by HPLC/MS/MS
KANG Wei, ZHOU Tuo, CHEN Yu, HE Jiming, LIU Jun, WU Kaifeng
Ningbo Institute of Forensic Science, Ningbo 315000, Zhejiang, China
Abstract

Objective To establish an assay of liquid chromatography in tandem with mass spectrometry for simultaneous determination of acetamiprid and pyridaben in blood samples.Methods Aliquots of 0.5mL blood samples were used for the analysis. Acetamiprid and pyridaben were extracted with 1.0mL acetonitrile to precipitate protein. The separation was performed on a Kinetex® 2.6μm-C18 100mm × 2.1mm analytical column by the Shmiadzu’s system of SIL-30AC high-performance liquid chromatography. The running parameters were the flow rate of 0.6mL/min, injection volume being 3μL, column temperature at 40℃. The mobile phases consisted of acetonitrile (mobile phase A) and water containing 20mM amm-onium acetate plus 0.1% formic acid (mobile phase B), flowing under gradient elution. The MS/MS analysis was conducted with AB QTRAP 6500 tandem mass spectrometry at the conditions of positive electrospray ionization mode (ESI+), multiple reaction monitoring (MRM) and external standard for quantification.Results Acetamiprid and pyridaben were well separated in blood samples with their respective retention time of 1.06 min and 2.74 min. Calibration curves for the two chemicals were linear within the range of 0.5~100ng/mL, with their regression equations as y=52753 x+1024 and y=98790 x+3466. For both acetamiprid and pyridaben, the limits of quantitation were 0.5ng/mL, recoveries more than 70%, and relative standard deviation showing less than 10%.Conclusion This method is simple, rapid and effective, suitable for determination of acetamiprid and pyridaben in blood samples.

Key words: acetamiprid; pyridaben; HPLC/MS/MS

啶虫脒（acetamiprid）, 分子式为C10H11ClN4, 分子质量222.68, 分子结构见图1, 属氯化烟碱类化合物, 是一种新型杀虫剂, 因其具有高效、低毒、对环境安全等优点被广泛应用。啶虫脒对人毒性较低、但大量服用出现中毒、致死等情况也见报道[1, 2, 3]。哒螨灵（pyridaben）, 分子式为C19H25ClN2OS, 分子质量364.9, 分子结构见图2, 为广谱、高效、杂环类杀螨剂, 对害螨具有很强的触杀作用, 可用于防治多种食植物性害螨。哒螨灵服用后导致中毒报道近年来也有[4]。啶虫脒和哒螨灵被某些厂商制成可湿性混合粉剂, 在使用中同时达到杀虫和除螨的功效。服用啶虫脒和哒螨灵导致中毒后的检验方法基本为气相色谱质谱联用法[5, 6, 7], 本文试图建立液相色谱-串联质谱联用法对中毒后血液检材中的啶虫脒和哒螨灵同时检测, 该方法相比气相色谱质谱联用法具有检材用量少、前处理方便、分析时间短、定性定量简单等优点, 可为案事件定性提供依据。

图1 啶虫脒的分子结构Fig.1 Molecular structure of acetamiprid

图2 哒螨灵的分子结构Fig.2 Molecular structure of pyridaben

1 仪器与试剂
1.1 仪器

液相色谱仪Shimadzu LC-30AD, 配备SIL-30AC自动进样器, CTO-20AC柱温箱（日本岛津公司）; 串联质谱仪 AB SCIEX QTRAP 6500, 配备ESI离子源, 三重四级杆复合线性离子肼质量分析器（美国AB公司）; 分析天平XS105(d=0.01 mg)（日本 METTLER TOLEDO）。

1.2 试剂、材料

乙腈（LC-MS, 99.9 %, 德国默克公司）, 乙酸铵(LC-MS, 99 %)、甲酸(LC-MS, 98 %)（上海安谱公司）, 纯水（美国Millipore公司）, 啶虫脒标准品(98 %)、哒螨灵标准品(99 %)（德国Dr.Ehrenstorfer公司）。

2 实验部分
2.1 色谱条件的优化与选择

Kinetex® 2.6μ m C18 100× 2.1mm色谱柱, 流速0.6 mL/min, 进样量3 μ L, 柱温40 ℃。在流动相方面, 本文比较了甲醇（A）和水（B）、甲醇（A）和20 mM乙酸铵+0.1 %甲酸水溶液（B）、乙腈（A）和20 mM乙酸铵+0.1 %甲酸水溶液（B）三种流动相组合, 结果显示使用第一组流动相组合色谱峰出现拖尾现象, 保留时间不稳定, 使用第二组流动相组合哒螨灵出峰时间偏晚, 分析时间较长, 使用第三种流动相组合啶虫脒、哒螨灵分离效果、峰形良好, 出峰时间均在3 min以内, 保留时间稳定。在洗脱方法上, 本文比较了等度洗脱和梯度洗脱, 最终选择梯度洗脱, 确保了两物质分离良好, 保留时间稳定, 梯度洗脱条件见表1。上述条件下啶虫脒和哒螨灵的保留时间分别为1.06 min和2.74 min, 见图3。

表1 梯度洗脱条件 Table 1 Conditions for gradient elution

图3 啶虫脒和哒螨灵的MRM色谱图Fig.3 MRM chromatograph of acetamiprid and pyridaben

2.2 质谱条件的优化与选择

离子源参数：电压5500 V, 温度 500 ℃, 气帘气40 psi, 喷雾气、辅助气55 psi。啶虫脒和哒螨灵用乙腈分别配制成10 ng/mL的标准溶液, 用针泵直接进样, ESI+电离, 通过Q1模式扫描, 确定啶虫脒和哒螨灵的母离子分别为223.1和364.9。通过Production模式扫描, 分别选择强度最高的3个子离子, 对碰撞能量CE值进行比较优化, 通过逐渐改变碰撞能量, 使母离子的强度约占最大子离子强度的1/3。选择母离子与强度最高的2个子离子, 组成2对离子对作为定性离子, 以最强的1对离子对作为定量离子。通过MRM模式扫描, 最终确定碰撞能量CE和去簇电压DP。上述各条件见表2。

表2 啶虫脒和哒螨灵的质谱条件 Table 2 Parameters of mass spectrum for acetamiprid and pyridaben
2.3 标准溶液配制

精确称取啶虫脒和哒螨灵标准品各10 mg, 分别用乙腈配制成1 mg/mL的标准储备液。精确量取上述标准储备液1 mL于100 mL容量瓶中, 乙腈定容配制成10 μ g/mL的标准工作液。实验中所用标准溶液均从上述标准工作液中稀释制得。

2.4 样品前处理

取血液检材0.5 mL于尖底试管中, 加入1.0 mL乙腈沉淀蛋白, 振荡5 min, 13 000 r/min高速离心30 min, 取上清液过0.22 μ m有机滤膜, 滤液供仪器分析。

3 方法学验证
3.1 标准曲线、线性范围

将啶虫脒和哒螨灵的标准工作液依次用乙腈稀释成0.1、0.5、1.0、5.0、10.0、50.0、100.0 ng/mL的
啶虫脒和哒螨灵标准溶液, 按2.1和2.2条件仪器进样分析。以标准溶液的浓度为横坐标, 定量离子的峰面积为纵坐标做线性回归。在实验条件下, 啶虫脒和哒螨灵在0.1 ~100.0 ng/mL浓度范围内呈现良好的线性, 线性方程分别为y=124436x +3291(r=0.99949)和y=333994 x +8017(r=0.99985)。

3.2 工作曲线、线性范围和定量限

取空白血液检材, 依次配成0.5、1.0、5.0、10.0、
50.0、100.0 ng/mL的啶虫脒和哒螨灵加标样品, 按2.4步方法处理, 仪器进样分析。以加标样品的浓度为横坐标, 定量离子的峰面积为纵坐标做线性回归。在实验条件下, 啶虫脒和哒螨灵在0.5~100 ng/mL浓度范围内呈现良好的线性, 线性方程分别为y=52753x+1024（r=0.99847）和y=98790x+3466（r=0.99895）。以工作曲线最低点浓度0.5 ng/mL做为方法的定量限。

3.3 回收率和精密度

取空白血液检材, 依次配成0.5、10、100 ng/mL
的啶虫脒和哒螨灵加标样品, 按2.4步方法处理, 进行3个浓度水平的回收率实验, 每个浓度水平做6次平行测定, 结果啶虫脒和哒螨灵的平均回收率均大于70 %, 相对标准偏差均小于10 %（见表3）。

表3 啶虫脒、哒螨灵的回收率和精密度 Table 3 Recovery and precision for acetamiprid and pyridaben
4 结果讨论

通过以上实验分析, 本文建立了血液检材中啶虫脒和哒螨灵的直接沉淀蛋白法提取、液相色谱-质谱联用定性定量检测的方法。血液检材采取乙腈直接沉淀蛋白法较传统的液液提取、固相萃取法具有检材用量少、前处理简便、回收率高等优点, 液质联用MRM模式扫描定性定量较气相色谱-质谱法相比具有分析时间短、检出限低、选择性强等优点, 提高了检验效率。

5 案例运用

2016年3月某地发生一起服毒自杀案件, 在现场发现“ 啶虫哒螨灵” 包装袋1个, 当地公安机关取死者心血5mL送检, 要求进行啶虫脒和哒螨灵定性定量检验。本实验室按照上述方法检验, 在送检的死者心血中检出啶虫脒和哒螨灵成份, 浓度分别为1.7μ g/mL和1.1μ g/mL。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
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