引用本文
徐海军, 叶志鹏, 钱利峰, 徐姚力, 宓晓峰, 张金燕, 李丽. 三种提取前处理方法对金属检材DNA分型的影响[J].刑事技术, 2017,42(5):372-374
XU Haijun, YE Zhipeng, QIAN Lifeng, XU Yaoli, MI Xiaofeng, ZHANG Jinyan, LI Li. Effects of Three Pre-extraction Treatments on STR Profiling of the DNA Obtained from Size-small Metal Articles[J]. Forensic Science and Technology,2017,42(5): 372-374  
doi: 10.16467/j.1008-3650.2017.05.006
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三种提取前处理方法对金属检材DNA分型的影响
徐海军, 叶志鹏*, 钱利峰, 徐姚力, 宓晓峰, 张金燕, 李丽
海宁市公安司法鉴定中心,浙江 海宁 314400
* 通讯作者：叶志鹏（1980—）,男,浙江海宁人,学士,主检法医师,研究方向为法医物证学。E-mail:yezhp@sina.com

第一作者简介：徐海军（1984—）,男,浙江海宁人,硕士,法医师,研究方向为法医物证学。E-mail:xinhaijin1232000@163.com

摘要

目的 探索一种适合于提取小尺寸金属检材上DNA的前处理方法。方法 选择M4型螺丝钉作为本研究的对象,经消毒去污处理,通过手握方式使人体脱落细胞覆盖于其表面,DNA提取前对螺丝钉分别采用三种不同的前处理方法（方法1：直接浸泡载体;方法2：震荡洗涤载体;方法3：二步擦拭载体）,对经提取并纯化的样本采用Amicon Ultra-0.5超滤膜浓缩。结果 方法2获得的STR分型谱带均一、平衡性好,等位基因峰值面积和检出率均显著高于方法1和方法3提取组;方法3提取组整体峰值面积较低,大部分测试样本STR分型存在等位基因丢失和非特异性扩增现象;方法1提取组中的样本基本未获得有效的STR分型谱带。结论 对尺寸较小、形状不规则的金属检材,如螺丝钉帽、铜丝铁线、铁珠铁片等,可采用方法2进行前处理,富集其上脱落细胞而后进行DNA提取,获得的DNA分型结果较为理想,方法1对检材DNA的提取前处理方式不宜采用。

关键词: 法医遗传学; 金属检材; DNA提取; STR基因座
中图分类号:DF795.2 文献标志码:A 文章编号:1008-3650(2017)05-0372-03
Effects of Three Pre-extraction Treatments on STR Profiling of the DNA Obtained from Size-small Metal Articles
XU Haijun, YE Zhipeng*, QIAN Lifeng, XU Yaoli, MI Xiaofeng, ZHANG Jinyan, LI Li
Haining Institute of Forensic Science, Haining 314400, Zhejiang, China
Abstract

Objective To explore a pre-extraction treatment suitable for DNA recovery from size-small metal articles.Methods Screws (size of M4), the tested samples of this research, were previously decontaminated and disinfected so as to make them covered with the exfoliated cells adhering onto their surfaces by hand holding, and then subjected to conduct three kinds of pre-extraction treatment (1: direct immersion of the screws into lysis solution; 2: oscillation to wash the screws in lysis solution; 3: two-step wiping of the screws via swabs) before DNA extraction. The collected and purified DNA was concentrated with Amicon Ultra-0.5.Results With the second kind of treatment, the STR typing revealed the DNA bands are of almost homogeneous and balanced, comparatively much better than the results obtained with the other two choices of treatment because of the two compared showing smaller areas of STR electrophoretic peaks and significant occurrence of allelic loss plus some non-specific amplifications. Even worse, the treatment of direct immersion of the screws just showed completely negative results because all the STR typing DNA bands were under the threshold set for this test.Conclusion In order to obtain the ideal STR profiling from size-small and shape-irregular metal articles (the DNA carriers), the second pre-extraction treatment, i.e., oscillation to wash the screws in this test, is suitable but the direct immersion way should absolutely not be suggested.

Key words: forensic genetics; metal sample; DNA extraction; STR loci

基层DNA检案工作, 经常会接触到一些体积较小的金属检材, 如铁片、钢珠、铁钉、螺丝、螺钉、螺帽、铁丝、铁线、铜丝、金属碎片等, 这类检材通常是犯罪分子在实施拆卸、破坏等行为时留下的, 其表面通常残留有一定量的人体脱落细胞, 具有较高的DNA检验价值。然而, 该类金属检材因其体积小、形状不规则、表面不平整、附着金属杂质多等因素, 往往会导致DNA检出率低。

针对衣物 [1, 2]、鞋帽 [3]、胶带 [4]、枪支 [5]、砖块 [6]、瓜壳 [7]等载体上的微量DNA提取方法有较多研究报道, 对小体积金属载体上微量DNA提取方法的研究却罕有涉及。本研究从基层实战出发, 以基层检案中常见的螺丝钉为研究对象, 分别采用直接浸泡载体、震荡洗涤去载体以及二步擦拭载体对螺丝钉进行DNA提取前处理, 旨在探索出一种适合于提取小体积金属检材DNA的检验方法, 以期为这类检材的处理提供借鉴和参考。

1 材料和方法
1.1 主要仪器和试剂

QIAcube纯化仪（QIAGEN公司, 美国）, 24孔2.0 mL恒温混匀仪（Eppendorf公司, 德国）, 高速离心机（Eppendorf公司, 德国）; QIAamp DNA Investigator Kit（QIAGEN公司, 美国）; 美国Life Technologies公司的Identifiler PlusTM试剂盒、9700型扩增仪和3130xL分析仪。

1.2 样本采集与编号

收集90个螺丝钉（M4型）, 统一规格为头部直径7.6 mm、钉长40 mm。用5 %次氯酸钠溶液浸泡15 min后, 用水洗净, 置超声波细胞破碎仪清洗30 min, 后置恒温烘箱中烘干, 取出待用。

选三名已知DNA分型的试验人员, 反复搓手2分钟后, 分别将30个螺丝钉以一定的力度握于手心5分钟, 持握过程中反复颠换螺钉的位置, 以保证手掌皮肤均匀接触每个螺钉。将每名试验人员手中的螺钉分为A、 B、 C三组, 每组10个, 第一试验人手中的螺钉编号为A1~A10、B1~B10、C1~C10, 第二试验人手中的螺钉编号为A11~A20、B11~B20、C11~C20, 第三试验人手中的螺钉编号为A21~A30、B21~B30、C21~C30。

1.3 DNA提取

结合三种不同的检材前处理方法对上述螺钉样本作DNA提取。

方法1：将编号为A1~A30的螺丝钉分别放入2.0 mL离心管中, 加入500 µ L ATL（高浓度盐酸胍）溶液和20 µ L PK溶液（20 mg/mL）, 56 ℃恒温混匀仪900 r/min消化2 h, 13 000 r/min离心5 min后, 转移上清液至QIA-Cube核酸纯化仪中进行样本提取, 洗脱体积为40 µ L。

方法2：将编号为B1~B30螺丝钉分别放入2.0 mL离心管中, 加入500 µ L ATL溶液, 在室温震荡仪中以2000 r/min反复震荡10 min, 用镊子移除管中螺丝钉, 加入20 µ L PK溶液（20 mg/mL）, 56 ℃恒温混匀仪900 r/min消化2 h, 13 000 r/min离心5 min后, 上清液置QIA-Cube核酸纯化仪进行样本提取, 洗脱体积为40 µ L。

方法3：用植绒拭子对编号为C1~C30的螺丝钉表面进行干湿两步法擦拭处理, 擦拭后的拭子置于2.0 mL离心管中, 加入500 µ L ATL溶液与20 µ L PK溶液（20 mg/mL）, 56 ℃恒温混匀仪900 r/min消化2 h, 13 000 r/min离心5 min后, 转移上清液至QIA-Cube核酸纯化仪进行样本提取, 洗脱体积为40 µ L。

将上述纯化获得的各试验样本, 分别用Amicon Ultra-0.5超滤管浓缩处理, 终体积约10 uL。

1.4 STR复合扩增及检测分析

提取的模板DNA使用Identifiler PlusTM试剂盒在9700型扩增仪上进行扩增。PCR反应选择10 µ L反应体系, 30循环, 反应体系中含DNA模板2 µ L, Reaction Mix 4 µ L, Primer Set 2 µ L, H2O 2 µ L。用3130xL分析仪对扩增产物进行毛细管电泳分离。

1.5 STR分型结果分析与统计

通过Genemapper ID-X软件对各样本DNA检验结果进行图谱分析, 统计三种提取方法获得的STR分型图谱中检出等位基因峰高的平均值、检出基因座数量、等位基因丢失情况。若完整的16个基因座（包括15个常染色体STR基因座及Amelogenin基因座）全部检出则为“ 成功” 检出, 而检出9个以上STR基因座及Amelogenin基因座（可满足数据库CODIS比对要求）为“ 有效” 检出。

2 结果与分析

根据A、B、C三组试验测试样本STR分型图谱, 统计等位基因峰高面积平均值和成功、有效检出样本的数量, 并分析各组样本STR分型谱带, 结果见表1。

表1 三种检材前处理方法STR分型结果比较 Table 1 Comparison of STR profiles obtained from three methods of pre-extraction treatment for the samples

A组的30个样本均未获得有效的STR分型谱带, 等位基因峰高面积范围分别是0~102.12 RFU、0~73.46 RFU、0~89.67 RFU; B组STR分型结果较好, 等位基因的峰高面积范围分别是690.82~1403.52 RFU、710.25~1247.16 RFU、684.18~1099.44 RFU, STR分型谱带整体均一平衡, 等位基因峰高面积、样本检出数量均显著高于A组和C组; C组的30个样本获得的STR分型谱带整体峰高面积较低, 分布范围分别是80.79~893.44 RFU、25.12~545.66 RFU、46.53~680.42 RFU, 且样本等位基因丢失现象较普遍, 主要表现在D18S51、D2S1338、D16S539等长片段基因座位点的丢失, 部分样本的基因座出现非特异性扩增现象, 与被检验人员的DNA分型不一致。

3 讨论

在基层检案中, 通常采用直接浸泡检材（即携带DNA的载体）的处理方法对小体积检材进行消化裂解。本研究中, 将螺丝钉直接浸泡裂解未获得有效的STR分型图谱。推测可能与最终获得的DNA纯化样本中金属离子浓度过高, 抑制了PCR反应有关。张子龙 [8]、张广峰 [9]以及黄艳梅等的研究 [10]表明金属离子会抑制PCR扩增反应, 本研究螺丝钉直接浸泡于裂解液中消化2小时, 螺丝钉表面的铁、镁、铜、锌等金属元素将会以离子形式进入裂解液, 硅胶膜法和超滤膜浓缩处理虽有一定的纯化作用, 但获得的纯化样本中金属离子仍有较高浓度, 从而会抑制PCR扩增反应。

震荡洗涤后移去螺丝钉和直接浸泡螺丝钉的处理方法相比, DNA提取效果显著提高, 说明剧烈震荡洗涤载体可使载体表面的脱落细胞被富集转移至液相中, 而移去载体后进行裂解, 又可防止金属离子被大量裂解游离入裂解液中对PCR扩增反应的影响。李承承 [11]的研究也对震荡洗涤载体获得脱落细胞有类似报道, 与本文研究结果一致。

通过植绒拭子擦拭螺丝钉表面的脱落细胞, 纯化浓缩后获得的DNA分型结果常出现等位基因位点丢失、STR分型不完整的现象, 甚至部分样本检测结果出现有非特异性扩增谱带, 其有效及成功检出数量不能达到基层检案的要求, 这可能与螺丝钉体积小、形状不规则、表面不平整, 擦拭获得的脱落细胞量较少有关, 因而影响了DNA的检验结果。

综合上述三种检材前处理方法, 可以认为, 对形状不规则、体积较小的金属检材, 如螺丝钉帽、铜丝铁线、钢珠铁片等, 可采用剧烈震荡洗涤载体而后移去载体再行裂解的方法进行DNA提取, 所获得的DNA分型结果较为理想。鉴于金属检材的性质, 不宜采用直接浸泡载体裂解的方式进行DNA提取。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
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