单倍型（haplotype）是指在一条染色体或线粒体上, 紧密连锁的多个等位基因的线性组合, 每一种组合方式即为一种单倍型^[6]。更进一步地讲, 单倍型是具有统计学关联性的遗传标记, 可由多个SNP位点构成, 包含丰富的遗传信息, 研究单倍型比单个SNP位点具有更好的分析效果^[7]。近年来单倍型在法医学中的应用越来越广泛, 主要涉及Y染色体、X染色体及线粒体上STR和SNP多态性的研究。

2012年, 美国耶鲁大学Kidd教授研究团队在前期单倍型相关研究基础上, 从长度小于10KB的区域内选取位置相对靠近的SNP, 并避开易发生重组的位点, 最终筛选出8个迷你单倍型基因座（mini-haplotype）。通过对45个群体进行检测, 结果显示筛选的8个迷你单倍型基因座的高杂合度及群体分布差异性能够提供亲权鉴定及种族推断需要的相关信息^[8]。为了进一步筛选更适合法医学应用的单倍型基因座, Kidd教授团队于2013年首次将微单倍型（microhaplotype）遗传标记引入法庭科学领域。相较于迷你单倍型, 微单倍型的片段长度更短, 其定义是在200 bp范围内2~5个SNP的组合^[9]。由于微单倍型基因座内含有多个SNP位点, 所以微单倍型是多等位基因遗传标记, 包含更加丰富的遗传信息^[10]。

人类基因组基因命名委员会（HUGO Gene Nomenclature Committee）已呼吁研究人员对相关领域的基因座进行命名与归类, 统一的命名将更有利于遗传数据的整理与归类。目前, 国际上对于微单倍型遗传标记尚无公认的命名规则。Kidd^[9]教授在前期工作基础上, 推荐命名规则如图1。其中, 以mh16KK-049基因座为例, “ mh” 为统一字母前缀, 即微单倍型英文字母缩写; “ 16” 表示该基因座所处染色体编号; “ KK-” 代表Kidd教授实验室名称; “ 049” 为该基因座的顺序编号, 即Kidd教授研究团队筛选的第49个微单倍型基因座。此外, 共列举16个代表性微单倍型基因座（见表1）。

图1

Fig.1

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	图1 Kidd推荐的微单倍型命名规则[11]Fig.1 The nomenclature of microhaplotype by Kidd[11]

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 代表性微单倍型基因座列表[9, 12, 13] Table 1 List of the representative microhaplotype loci [9, 12, 13] 名称 包含SNP个数 包含SNP位点 染色体编号 长度/bp mh02KK-003 3 rs260694/rs11123719/rs11691107 2 124 mh09KK-035 2 rs3118582/rs10776839 9 193 mh12KK-046 2 rs1503767/rs11068953 12 71 mh14KK-048 2 rs12717560/rs12878166 14 158 mh16KK-049 5 rs9937467/rs17670098/rs17670111/rs12929083/rs9926495 16 173 mh22KK-061 3 rs763040/rs5764924/rs763041 22 146 mh22KK-069 2 rs8137373/rs2235845 22 78 mh15KK-095 2 rs2433354/rs2459391 15 99 mh15KK-104 3 rs11631544/rs10152453/rs80047978 15 137 mh01KK-117 4 rs17413714/rs2772234/rs1610401/rs1610400 1 186 mh02KK-134 4 rs12469721/rs3101043/rs3111398/rs72623112 2 103 mh09KK-153 3 rs10125791/rs2987741/rs7047561 9 112 mh11KK-180 4 rs12802112/rs28631755/rs7112918/rs4752777 11 193 mh01KK-211 3 rs2490423/rs16835127/rs2341465 1 148 mh21KK-315 3 rs8126597/rs8131148/rs6517971 21 145 mh21KK-320 4 rs2838081/rs2838082/rs78902658/rs2838083 21 185

表1 代表性微单倍型基因座列表[9, 12, 13] Table 1 List of the representative microhaplotype loci [9, 12, 13]

二代测序, 也称下一代测序（next generation sequencing, NGS）或大规模并行测序（massively parallel sequencing, MPS), 在科研和临床诊断领域已得到广泛应用。相比传统的DNA测序方法, 二代测序技术具有高通量、高速度、集成化、低成本等显著优势, 在法医遗传学领域也具有重要应用前景。测序技术是序列多态性遗传标记最好的检测手段^[14]。微单倍型是SNP的线性组合, 其本质仍然是SNP, 二代测序技术能够一次性获得复合体系中SNP位点的全部基因分型, 也同时获得全部微单倍型遗传标记的准确分型, 学者普遍认为二代测序将会是微单倍型检测的金标准^{[9, 12, 13]}。四川大学张林教授研究团队^{[15, 16]}
研发了微单倍型分型软件, 并首次选用Miseq二代测序技术平台对微单倍型进行研究, 为中国人群微单倍型遗传多态性提供了初步数据, 对微单倍型遗传标记应用于个体识别及亲权鉴定的可行性进行评估。

高分辨熔解（high resolution melting, HRM）曲线是新兴的基因分析技术, 它的原理是将特定的染料嵌入DNA双链中, 通过实时监测温度变化过程中饱和染料与扩增产物的结合情况描绘出特定的熔解曲线, 从而检测出扩增片段上的序列差异^[17], 具有成本低、通量高、速度快、结果准确等特点, 在SNP分型、DNA甲基化相关研究领域已发挥重要作用。Nakahara Hiroaki^[18]等人对27个包含复合SNP位点的单倍域（每个单倍域长度小于100bp）在个体识别中的实用性进行了评估, 通过HRM分析筛选的7个单倍域（1q25、1q42.2、3p24、10p13、11p15.1、14q12-q13和 20q12）具有良好的多态性, 能够作为法医物证鉴定的辅助工具, 且适用于降解检材的分析。

Chen等^[15]尝试使用单链构象多态性分析方法对337例无关个体进行微单倍型分型研究, 获得了较好的遗传多态性。单链构象多态性（single strand conformational polymorphism, SSCP）分析的原理是将PCR扩增产物变性, 变性后的单链DNA片段呈现一定的空间构象。在中性聚丙烯酰胺凝胶电泳中, 由于不同单链DNA的碱基排列顺序差异或单碱基突变, 导致空间构象存在差异, 进而改变电泳迁移率, 即构象不同的单链DNA处于不同的电泳位置。最后通过银染显影观察目的片段带型的差别。但是要确定目的片段的序列以及SNP位点的分型, 仍然需要进行测序, 并且PCR-SSCP技术不能一次检测多个基因位点, 通量小, 对电泳的条件要求较高, 在一定程度上会出现假阴性的结果, 影响结果的判读。

综上所述, PCR-SSCP技术具有成本低、操作简便等特点, HRM技术已发展成为SNP基因分型、点突变筛查的重要手段, 但上述两种方法是通过电泳图谱或熔解曲线的差异来检测特定位点基因型差异, 并不能直接获得DNA序列信息。相比之下, 二代测序技术可检测DNA序列多态性, 直接读取微单倍型分型, 随着测序技术的不断优化及测序平台的普及, 有望成为微单倍型遗传标记的主流检测技术。

混合生物检材是法医DNA实验室常见的疑难检材类型。多年来, 法医DNA工作者在混合生物物证检验方法方面开展了大量研究, 涌现出差异裂解法、激光显微切割、抗体磁珠、软件拆分等多种混合生物检材检验方法。以上方法虽各有优势, 却各具短
板^{[19, 20, 21]}。至今, 混合生物检材检验分型仍然是法医物证领域公认的技术难题之一。PCR扩增是STR检验的必要实验环节之一, 然而由于STR是重复序列, 在扩增过程中会由于复制滑脱伴随出现影子峰（stutter peak）。影子峰是重复序列复制的固有现象, 没有办法去除。实际工作中发现, 影子峰主要出现在比目的等位基因减少一个重复单元的位置, 峰高或峰面积占目的等位基因的比例不等, 通常在3 %~15 %, 但在比目的等位基因增加一个重复单元和减少两个重复单元的位置也可能出现。影子峰的存在, 对单一样本的正确分型不会产生严重的影响, 但对于混合样本分型的干扰非常严重。特别是在极端混合比例DNA样本中, 微量成分的目的峰与主要成分的影子峰非常相似, 严重干扰混合分型拆分。因此, 有必要考虑使用其他遗传标记辅助解决混合DNA样本检验问题。

SNP遗传标记不存在影子峰现象, 但由于其是二等位基因遗传标记, 在混合DNA分型中作用有限。微单倍型兼具STR和SNP遗传标记的优势。微单倍型为多等位基因遗传标记, 且不存在影子峰干扰, 在混合DNA检验领域具有巨大潜力, 而且, 比STR突变率更低, 扩增子更短, 适于法医遗传学应用。为了量化微单倍型基因座区分混合样本的效能, Kidd等人引入有效等位基因数目（effectivenumber of alleles, Ae）的概念^[11], 并对百余个微单倍型基因座进行量化评估。有效等位基因数目是一个基因座上频率相等或相近的等位基因的数目, 其计算公式为1/∑ pi²（其中pi为等位基因i的频率）。结果表明, Ae值与微单倍型区分混合样本的能力大小呈正相关关系, 当仅检测5个平均Ae值为5的微单倍型基因座时, 其区分混合样本的累计效能已达0.99933。

随着跨国案件的不断增加以及我国多民族混居的特征, 确定现场生物检材的种族地域特征已成为研究热点。Kidd等^[9]构建了31个微单倍型的复合检测体系, 对世界人群（来自54个群体的2530名个体）微单倍型多样性进行研究, 结果表明, 等位基因频率分布的显著差异可区分非洲、西南亚、东亚、太平洋地区及美洲人群, 但是种族推断的效能低于之前报道的55个SNP位点的复合体系。Chen等^[15]结合我国人群遗传特点, 采集337例无关个体样本（分别来自汉族、维吾尔族、侗族、壮族及台湾）, 采用单链构型多态性分析方法对L18C1A微单倍型基因座进行检测, 结果表明该基因座98.65 ％的变异来自群体内部, 1.35 ％的变异发生于群体之间, 汉族与维吾尔族人群微单倍型频率分布差异显著, 且维吾尔族人群的遗传结构与其他4个群体差异较大。综上, 微单倍型遗传标记具有良好的种族推断潜力。

2013年, 研究人员专门为亲权鉴定选取了48个微单倍型基因座, 其中28个微单倍型基因座作为遗传标记的效能等同于45个SNP检测体系^[12]。如前所述, 在Kidd团队^[9]构建的31个微单倍型复合体系中, 微单倍型基因座的片段长度分布于18bp至201bp之间, 杂合度中位数为0.55, 随机匹配概率低于10^-15, 其法医学参数效能与CODIS系统中13个STR基因座相当, 具有良好的个体识别及亲权鉴定能力。

Wang等人^[22]从UCSC和dbSNP数据库选取25个微单倍型基因座, 选用Miseq二代测序技术平台对24个样本（包含阳性对照9947, 6对父子样本, 4个汉族样本、3个维吾尔族样本和4个台湾地区样本）进行了等位基因频率和法医学参数的计算。结果表明两个位于6号及8号染色体的微单倍型基因座具有良好的多态性, 杂合度分别为0.6667/0.4444, 个体识别效能（DP）达到0.7593/0.8148, 并且6对父子样本在这两个基因座上均符合孟德尔遗传规律, 没有测序错误的发生, 有效测序深度均达到90 ％以上。上述参数表明通过二代测序确证的微单倍型基因座能够运用于法医物证鉴定中的亲权鉴定与个体识别。