陈旧碎骨组织DNA检验
李永久1, 郭磊2, 乔婷1, 凃政1
1. 公安部物证鉴定中心,北京100038
2. 安庆市公安局刑警支队,安徽 安庆 246000

第一作者简介:李永久(1990—),男,山东东营人,硕士,法医师,研究方向为法医遗传学。E-mail:li_yongjiu@126.com

摘要

碎尸案中,因骨骼碎小且数量多又损毁严重,会使之难以与其他动物骨骼区分开,从而成为法医DNA鉴定的一大难题。本文利用扫描电镜进行骨骼种属鉴定,通过哈氏系统的形态学特征区分人骨与其他动物骨骼,大大减少了DNA检验的工作量,而后续脱钙与裂解处理同时进行又缩短了反应时间。一起10年前碎尸案的碎小骨块据此而成功地快速鉴定,一种适用于陈旧碎骨DNA的快速检验方法也因此建立。

关键词: 碎骨; 扫描电镜; 短串联重复序列; DNA检验
中图分类号:DF795.2 文献标志码:B 文章编号:1008-3650(2017)03-0257-02 doi: 10.16467/j.1008-3650.2017.03.021
DNA Test from Small Pieces of Aged Broken Bones
LI Yongjiu1, GUO Lei2, QIAO Ting1, TU Zheng1
1. Institute of Forensic Science, Ministry of Public Security, Beijing 100038, China
2. Anqing Public Security Bureau, Anqing 246000, Anhui, China
Abstract

In the case of corpse-chopping, the numerous bone fragments, usually of serious degradation, are difficult to distinguish from the animal’s and susceptible to be contaminated, therefore making their DNA test a major problem in forensic identification. This paper reports a successful attempt on solving such a case. The skeletal species was determined by the Haversian morphological characteristics with a scanning electron microscope. The positive human bone pieces were crushed to increase the amount of extracted DNA. Decalcification was meantime carried out with the cleavage reaction. Finally, a silicon membrane was used to harvest the high-quality DNA so that the complete DNA profile had been obtained. Through the above endeavor, nine pieces of fragmental bones out of 32 ones from a corpse-dismantling case, which kept unsolved for 10 years, have been identified as human’s and their identity matches to the victim.

Key words: broken bones; scanning electron microscope (SEM); short tandem repeat (STR); DNA test

近年来, 随着DNA提取技术的发展, 骨骼DNA检验方法日渐成熟, 检验效率及成功率不断提高。但在一些碎尸类案件中, 由于骨骼碎小, 数量众多, 污染严重, DNA高度降解, 导致种属和DNA鉴定的难度增加, 成为法医鉴定领域中一大难题。本文通过对一起碎尸案件中碎小骨块的成功鉴定, 摸索出了一种适用于陈旧碎骨DNA的快速检验方法。

1 案例资料
1.1 简要案情

2006年1月24日, 两犯罪嫌疑人将某受害人诱至一聊吧, 实施抢劫、杀害并碎尸, 碎尸块被丢弃到一河渠中。同年4月30日, 若干碎骨块被打捞出水。2015年7月, 当地有关单位将32份碎骨块送检, 要求做DNA检验。

1.2 案件检验

1)显微检验。用手术刀削取碎骨截面置于取样台上, 用Quanta FEG650扫描电镜(FEI, USA)检验。

2)样本预处理及DNA提取。取1.2.1中鉴定为人骨的骨块, 用手术刀片刮净其表面污垢, 除去外层组织。切取碎骨薄片30~50 mg置于1.5 ml EP管中, 用无水乙醇浸泡10 min, 乙醚浸泡10 min, 置于通风柜中干燥。顺序加入200 μ L Bone Incubation Buffer(Promega, USA)、200 μ L脱钙液(0.5 mol/L EDTA pH8.0)、20 μ L DTT溶液(1 mol/L)以及20 μ L蛋白酶K溶液(20 mg/mL), 震荡后置于56 ℃保温2 h。按前量补加一次蛋白酶K和DTT, 再消化2 h。离心取上清, 以QIAquick PCR Purification Kit试剂盒进行DNA提取纯化。

3)STR分型检验。采用GlobalFiler™ PCR复合扩增试剂盒( Life Technologies, USA)扩增, 产物经3500 xL遗传分析仪(Life Technologies, USA)检测, ID-X 1.4软件作STR分型。操作过程按照试剂和仪器说明书进行。

1.3 检验结果

经扫描电镜检验, 其中9份碎骨块确认存在人类骨骼哈氏系统结构(图1), 其人类STR基因座分型也成功获得(图2)。经与现场受害人血迹STR分型比对, 所有基因座分型结果一致。

图1 部分送检的碎骨块经扫描电镜鉴定出人骨骼哈氏结构Fig.1 Partial SEM photograph showing human Haversian morphological structure of one broken bone from the scene

图2 受害人STR分型(上)和现场提取碎骨STR分型(下)Fig.2 Victim’ s STR profiling (upper) matching to that of the broken bone (bottom) from scene

2 讨论

本案送检骨骼数量较多, 形状不一且体积较小。因抛尸地附近有许多小餐馆, 厨房垃圾中包括一些动物碎骨, 故需鉴定骨骼种属以确定人骨, 从而减少DNA检验的工作量。

首先根据法医人类学对骨骼种属作分类, 筛选出人骨。通常, 若骨骼样本较完整, 则较易将人骨与动物骨区分开, 但若只有很少一点骨块或骨骼外形受到严重破坏, 则鉴别起来就很困难。本案犯罪嫌疑人将受害人杀害并分尸, 骨骼碎片体积较小, 最大的一块骨骼残片也仅约2.5 cm长, 故通过常规形态学检验无法将其与动物的骨骼相区分。哈氏系统, 又称骨单位, 在长骨中起支撑作用, 位于内外骨板之间, 由多层同心圆排列的哈弗斯骨板围绕中央管而形成[1]。人骨哈氏系统通常呈圆形或椭圆形, 形状规则, 分布均匀, 边缘线清晰, 无丛状骨及骨单位带; 而动物骨哈氏系统与人骨差异明显, 并且可见丛状骨及骨单位带[2]。据此, 再结合人与动物骨骼的其他形态学和结构差异, 本案经扫描电镜观察分析, 最终在32份检材中确认出9块碎骨块为人骨。

DNA提取常用EDTA以脱去羟基磷灰石中的钙元素。常规骨骼DNA提取方法耗时较长[3], 脱钙需36~40 h, 裂解用12 h, 方可进行DNA纯化, 故初步获得骨骼STR分型要经4~5 d。本文有如下改进:一是将脱钙与裂解过程同步进行。骨骼由于富含Ca2+、Mg2+等离子, 在保护DNA的同时, 也阻碍了骨骼的裂解。本检验通过EDTA吸附骨间质中的Ca2+等离子以及添加骨骼孵育缓冲液, 在促进骨细胞DNA释放, 缩短DNA提取时间的同时, 又防止了Ca2+等离子留在洗脱后的DNA溶液内对PCR的抑制[4]。二是采用硅膜纯化的方法。本案骨骼样本碎片化严重, 并在水中浸泡三个月又经放置近十年才送检, 其DNA降解严重, 提取的DNA模板中存在大量小片段DNA分子, 故扩增时会产生不平衡扩增而导致大片段STR条带缺失。因此本案利用SiO2膜选择性过滤掉小片段DNA, 从而有效回收了高质量的DNA模板, 获得的STR分型理想可靠。本文提供了一种适用于陈旧碎骨DNA的快速检验方法, 可为类似案件借鉴。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
[1] 朱建民. 骨生物学及其进展[J]. 临床骨科杂志, 1999, 2(4): 308-313. [本文引用:1]
[2] 陆惠玲, 郑晶, 姚亚楠, . 人与狗、猪、牛、羊长骨哈氏系统图像分析的比较[J]. 法医学杂志, 2006, 22(2): 97-100. [本文引用:1]
[3] 贾东涛, 韩海军, 张玉红, . 陈旧骨骼DNA提取方法的应用研究[J]. 中国法医学杂志, 2007, 22(4): 260-261. [本文引用:1]
[4] 凃政, 刘志芳, 陈松, . 牙齿的DNA提取及STR分型研究[J]. 刑事技术, 2007(5): 9-11. [本文引用:1]