日常检验中的三联体亲权鉴定案件3例。

GlobalFiler™ 试剂盒（ABI公司）, PP21试剂盒（Promega公司）, AGCU EX22试剂盒和AGCU 21+1试剂盒（中德美联公司）, 3500xL基因分析仪（ABI公司）, 9700型扩增仪（ABI公司）。

模板DNA的制备：采用Chelex100法提取模板DNA。

复合扩增及产物的分离与检测：10μ L扩增反应体系, 分别按不同试剂盒的操作手册进行扩增和检测。

数据分析：采用GeneMapper ID-X v1.4分析软件进行数据分析, 以标准阶梯等位基因为标准进行分型。

案例1和案例2中, 采用AGCU EX22试剂盒进行扩增。案例1结果显示, 除D19S433外, 孩子其余STR基因座的等位基因均能从父亲或母亲中找到来源, 但在D19S433基因座上母亲和儿子都出现了OL等位基因（图1）。案例2结果显示, Penta D基因座上父亲和儿子都出现了OL等位基因（图2）。两个案例的OL等位基因均超过了等位基因阶梯范围, 落入了相邻的基因座内, 很难确定其属于哪个基因座。加做PP21试剂盒, 利用不同的引物序列进行扩增, OL等位基因还是难以区分。根据两种试剂盒检测得到的等位基因数、峰高面积、片段大小等因素综合考虑, 判断案例1中OL等位基因属于D19S433基因座, 计算后OL应命名为4。案例2中, OL等位基因属于Penta D基因座, 计算后OL应命名为20。为进一步证实判断, 对案例1中的样本又进行了D19S433基因座克隆测序, 得到其核心序列为CCTTCCTTCCTACCTTCTTTCCTT（反向）（图3）, 表明该OL等位基因应为D19S433基因座的4号等位基因。

图1

Fig.1

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	图1 D19S433基因座OL等位基因的分型图谱Fig.1 Genotyping profile of the OL allele of D19S433 locus

图2

Fig.2

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	图2 Penta D基因座OL等位基因的分型图谱Fig.2 Genotyping profile of the OL alleles of Penta D locus

图3

Fig.3

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	图3 基因座D19S433的OL等位基因测序结果Fig.3 The sequencing of OL allele gene of D19S433 locus

案例3中, 父亲、母亲和孩子三份检材均采用GlobalFiler™ 试剂盒进行扩增检测, 除D22S1045基因座外, 孩子的其余各基因座等位基因均能从父母中找到来源。而在D22S1045基因座上父亲为纯合子16, 母亲为纯合子15, 孩子为纯合子16（图4）。母亲和孩子的纯合子峰高为相邻基因座纯合子峰高的一半左右, 与临近的杂合子峰高相当。为进一步明确是否存在突变, 加做AGCU 21+1试剂盒, 显示所有基因座均符合遗传规律。在D22S1045基因座上, 父亲表现为纯合子16, 母亲为杂合子12, 15, 孩子为杂合子12, 16。母亲和孩子的两个杂合子高度相当, 比例均衡（图5）。故可以认定使用GlobalFiler™ 试剂盒, 母亲和孩子在D22S1045基因座上均出现了等位基因的丢失现象。这极易导致误判该基因座在由母亲传递给孩子的过程中发生了一步突变。

图4

Fig.4

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	图4 GlobalFiler™ 试剂盒中母亲和孩子的分型Fig.4 Genotyping profiles of mother and child by GlobalFiler kit

图5

Fig.5

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	图5 AGCU 21+1试剂盒中母亲和孩子的分型Fig.5 Genotyping profiles of mother and child by AGCU 21+1 kit

出现等位基因分型标准物以外的等位基因, 即off-ladder等位基因, 会给检测结果判读带来一定困难。陆惠玲[1]等人的研究把OL等位基因按其组成分为四类：1)重复单位完整重复, 但重复次数在ladder范围外; 2)不完整重复; 3)侧翼序列个别碱基的插入或缺失; 4)较大片断的缺失。案例1和案例2中发现的OL等位基因均超出Ladder范围, 属于第一种类型, 并且该位点遗传给了子代。

关于稀有等位基因的报道, 国内外也有很多^{[2, 3, 4]}。查询STRbase数据库, D19S433基因座定位于人类染色体19q12, 核心重复单位为AAGG, 案例1中检出的等位基因4已被收录。欧阳曙明^[4]等人在研究湖南人群的罕见等位基因中还发现D19S433基因座存在稀有等位基因19.2。Penta D基因座定位于人类染色体21q22.3, 核心重复单位为AAAGA, 案例2中检出的等位基因20尚未收录。曾艳红^[3]和陆惠玲^[1]在研究中国人群的罕见等位基因中发现, Penta D基因座除了存在稀有等位基因20以外, 还有稀有等位基因11.2、18、19、21、23。这些OL等位基因的发现和确证, 对于提高基因座个体识别能力、非父排除率等有重要的应用价值。

OL等位基因种类和数量众多, 一旦出现, 就需重复实验, 以排除电泳漂移、内标质量不佳等造成的误差, 然后再以ladder为分型标准进行命名, 必要时要应用不同的试剂盒相互验证或者对稀有等位基因进行测序, 从而保证结果准确可靠。

使用STR 试剂盒检验时, 有可能出现等位基因丢失的现象, 这是由于模板DNA在引物结合处的3′ 端附近存在碱基突变或插入/缺失, 使引物不能退火, 无法扩增, 导致无扩增产物。模板DNA中虽然存在这个等位基因, 但由于引物不能退火致使扩增失败, 这称之为无效等位基因^[5]。D6S1043、D19S433等基因座都曾报道过等位基因丢失的现象^{[6, 7]}。

案例3在采用GlobalFiler™ 试剂盒进行扩增检测时发现D22S1045基因座上父亲为纯合子16, 母亲为纯合子15, 孩子为纯合子16, 母亲和孩子不符合遗传关系, 怀疑产生了一步突变。进而加测AGCU 21+1试剂盒, 结果显示在21个基因座上, 包括D22S1045基因座, 孩子的各基因座等位基因均能从父亲或母亲中找到来源。D22S1045基因座, 父亲表现为纯合子16, 母亲为杂合子12, 15, 孩子为杂合子12, 16。采用重复实验排除实验操作带来的误差之后, 综合分析该案例的STR数据, 发现GlobalFiler™ 试剂盒中D22S1045基因座上母亲和孩子的纯合子峰高为相邻基因座纯合子峰高的一半左右, 与临近的杂合子峰高相当。而在AGCU 21+1试剂盒中, 母亲为杂合子12, 15, 孩子为杂合子12, 16, 母亲和孩子的两个杂合子高度相当, 比例均衡。据此可以判断, GlobalFiler™ 试剂盒的D22S1045基因座, 对于该案例中的母亲和孩子, 其等位基因12丢失了, 但本质上其实为一杂合子, 只是使用GlobalFiler™ 试剂盒的引物未能扩增出来。值得一提的是, 如果不加做位点进行验证分析, 就可能将母亲和孩子的D22S1045基因座误判为纯合子, 认为母亲和孩子之间发生了突变, 由15变为16, 这将会导致CPI计算错误, 影响鉴定的准确性。

当怀疑存在等位基因“ 丢失” 现象时, 可采用以下方法：1）用扩增片段长度差异较大的不同试剂盒进行检测。由于商品化的试剂盒需要同步扩增多个STR基因座, 为得到不同长度的扩增片段, 有些引物在设计时不得不靠近核心序列。扩增片段长度差异较大的不同试剂盒, 引物序列差异也较大, 能够避免模板DNA在引物结合处附近存在碱基突变造成的丢失。2）为进一步查明等位基因“ 丢失” 的原因, 应对该基因座单独设计长片段引物进行扩增, 必要时进行测序, 查明原因。

随着STR分型商业试剂盒的种类和位点越来越多, 被发现的OL等位基因和无效等位基因也会相应增多。在亲权鉴定中, 特别是孩子与父母同时检测出相同基因座具有同样的稀有等位基因时, 由于稀有等位基因发生的频率低, 因此会大大提高亲权鉴定中的累计父权指数（CPI）值。同时, 若出现孩子与父母的等位基因不符合遗传规律的情况, 应加做不同的试剂盒以便进行验证分析, 避免出现将等位基因丢失的情况误认为是突变, 必要时则还需测序以确定其分型。

综上所述, 在进行亲权鉴定时, 面对一些特殊的分型结果, 一定要引起高度重视, 综合运用多种方法, 如不同试剂盒扩增、测序分析等, 以确保分型准确性, 避免出现鉴定错误。