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周如华, 孙溢华, 孙元鹏, 石云杰. 自动化Chelex-100法在接触性检材DNA提取中的应用研究[J].刑事技术, 2017,42(3):206-208
ZHOU Ruhua, SUN Yihua, SUN Yuanpeng, SHI Yunjie. Automatic Batch Extraction of Touch DNA by Chelex-100[J]. Forensic Science and Technology,2017,42(3): 206-208  
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自动化Chelex-100法在接触性检材DNA提取中的应用研究
周如华1, 孙溢华2, 孙元鹏1, 石云杰1
1. 苏州市公安局刑事科学技术研究所,江苏 苏州 215131
2. 苏州市公安局吴中分局,江苏 苏州 215000

第一作者简介：周如华（1977―）,男,安徽定远人,学士,副主任法医师,研究方向为法医物证学。E-mail:zhouruhuadna@126.com

基金资助: 江苏省公安厅科研项目（No.201101001）
摘要

目的 使用Chelex-100方法在核酸载体分离板（96孔）上对接触性生物检材DNA进行载体分离和纯化,并将其与TECAN Freedom EVO150-8自动化工作站进行结合,建立起一种自动化、快速、灵敏、高效的DNA提取方法并探讨其在法医学中的应用价值。方法 在核酸载体分离板（96孔）上使用Chelex-100液裂解DNA,通过高速离心实现批量生物检材载体与DNA分离;通过编写EVO150-8自动化工作站应用程序实现批量生物检材的快速提取、PCR构建一体化过程;采用Identifiler Plus试剂盒进行PCR扩增,扩增产物经3500 xL遗传分析仪电泳,GeneMapper ID-X软件分析检测结果。结果 在994份生物检材中,成功获得456份检材STR分型,平均检验成功率在45.88 ％;对92份生物检材DNA提取及PCR构建,仅耗时60 min。结论 本研究应用核酸载体分离板（96孔）,建立的自动化Chelex-100法快速、高效、灵敏,适用于批量接触性检材的DNA检测。

关键词: 法医物证学; 自动化检验; 接触DNA; Chelex-100
中图分类号:DF795.2 文献标志码:A 文章编号:1008-3650(2017)03-0206-03 doi: 10.16467/j.1008-3650.2017.03.009
Automatic Batch Extraction of Touch DNA by Chelex-100
ZHOU Ruhua1, SUN Yihua2, SUN Yuanpeng1, SHI Yunjie1
1. Institute of Forensic Science and Technology, Suzhou Municipal Public Security Bureau, Suzhou 215131, Jiangsu, China
2. Wuzhong Branch of Suzhou Municipal Public Security Bureau, Suzhou, 215000, Jiangsu, China
Abstract

Objective To establish a batch extraction method for touch DNA by Chelex-100 injection into 96-well nucleic acid filtration plate through TECAN Freedom EVO150-8 automation workstation so as to build up an automatic, rapid, sensitive and highly efficient way to isolate and purify DNA.Methods Biological samples were lysed by Chelex-100 infusing into 96-well lysis purification plate. The lysate DNA was isolated from the carrier and precipitated into 96-well centrifugal collecting plate by high speed centrifugation. Automatic application programs were written for TECAN Freedom EVO150-8 to achieve both the rapid DNA extraction from massive biological samples and PCR construction. Amplified by Identifiler Plus kit, the DNA template and its product were subjected to capillary electrophoresis in 3500XL analyzer, having the resultant data analyzed with GeneMapper ID-X software.Results Of all 994 samples, 456 ones were successfully detected of their STR genotypes, obtaining a success rate of 45.88% for the detection of touch DNA. It takes only 58 minutes for 92 biological samples to conduct the DNA extraction and PCR construction with the method established here.Conclusions The DNA extraction method, that of isolating and purifying DNA by chelex-100 injecting into 96-well filtration plate through TECAN Freedom EVO150-8 automation workstation, is rapid, efficient and sensitive, applicable for massive touch DNA detection.

Key words: forensic genetics; automatic detection; touch DNA; Chelex-100

随着DNA检验技术灵敏度的提高和各级公安机关应用DNA破案的意识日益增强, 越来越多的案件需要进行DNA检验。针对大批量现场生物检材, 尤其是接触性生物检材DNA提取, 如何建立一种高效、快速、灵敏、大通量的DNA自动化检验方法是各级DNA实验室迫切需要解决的问题[1]。

本研究采用核酸载体分离板（96孔）, 在自动化工作站上使用Chelex-100法对接触性检材进行DNA的提取, 以探讨其对于大批量生物检材提取的效果以及应用价值。

1 材料与方法
1.1 实验样本

994份各类现场提取的生物检材, 附着于不同的载体上, 包括烟蒂51份, 饮料瓶73份, 手套83份, 电源网线接头111份, 作案工具273份, 门窗把手302份, 手套印101份, 上述检材均为本实验室日常案件检材。

1.2 主要仪器与试剂

TECAN Freedom EVO150-8核酸提取纯化工作站（TECAN公司, 瑞士）; Allegra X-30离心机（Beckman Coulter公司, 美国）; Co-Mix混匀仪（莱因特电子系统〔上海〕有限公司）; 9700型PCR扩增仪（Life technologies公司, 美国）; 3500xL遗传分析仪（Life technologies公司, 美国）; 核酸载体分离板（96孔）（南京多丽洋生物技术有限公司, 见图1）; Chelex-100纯化试剂盒(Promega公司, 美国); Identifiler Plus试剂盒（Life technologies公司, 美国）。

图1 核酸载体分离板（96孔）（上层：DNA裂解纯化板; 下层：DNA离心收集板）Fig.1 96-well filtration plates for nucleic acids (upper layer: lysis purification plate; lower layer: centrifugal collecting plate)

1.3 实验方法

1.3.1 EVO150-8自动化工作站改良及程序优化

改造EVO 150-8自动化工作站的加热底座, 使之与核酸载体分离板相匹配; 在自动化程序的基础上, 对提取程序进行优化, 使DNA提取纯化与PCR构建一体化完成, 增加程序灵活性[2]。

1.3.2 模板DNA提取

对于附着于不同载体上的生物检材, 分别采取棉签擦拭（饮料瓶、电源网线接头、作案工具、门窗把手、手套印）、粘取器粘附（手套）或直接剪取（烟蒂）等方式转移至核酸载体分离板（96孔）裂解纯化板各个孔中, 通过TECAN Freedom EVO150-8工作站将Chelex-100液批量加入其中; 将核酸载体分离板（96孔）56 ℃水浴加热20 min, 98 ℃水浴煮沸8 min, 剧烈震荡10 s; 高速离心使载体与DNA裂解液完全分离, 弃去上层含有载体的96孔板, 将下层DNA离心收集板置于TECAN Freedom EVO150-8工作站中进行PCR构建。92份生物检材提取纯化及PCR构建过程约60 min（96孔板中设置阴性、阳性对照, 预留2孔为电泳Ladder位置）。

1.3.3 复合扩增及产物电泳

采用Identifiler Plus试剂盒按说明书操作进行扩增检验, 扩增产物经3500xL遗传分析仪电泳后使用GeneMapper ID-X软件进行数据分析。

2 结果与讨论

本研究使用的PCR扩增试剂盒共包含15个STR基因座和性别基因座, 本实验DNA成功检出标准为至少有13个STR基因座以及性别基因座的图谱峰值在100RFU及以上。994份生物检材经核酸载体分离板裂解去载体和自动化工作站提取纯化后, 有456份成功获得STR基因分型, 平均检验成功率在45.88 %。其中烟蒂、饮料瓶检验成功率达90 %以上; 手套、电源网线接头检验成功率在70 %以上; 对于作案工具、门窗把手、手套印等生物检材, 其平均检验成功率为29.44 %。994份检材具体检验结果见表1。

表1 994份检材DNA检验结果统计 Table 1 Statistics for 994 samples of touch DNA to detect

Chelex-100法整个反应过程都在一个离心管中进行, 能有效避免样本转移过程中的损耗和二次污染, DNA回收率可达到100 %[3], 而一般磁珠法DNA回收率仅有60 %~70 %[4]。并且Chelex-100法操作简单快速, 已有研究报道使用自动化Chelex-100法对于92份血痕样本进行DNA提取, 用时在90 min左右[5]。本研究在传统Chelex-100法和自动化工作站的基础上, 使用了核酸载体分离板（96孔）, 该装置中的滤膜孔径达到5 μ m, 通过高速离心能将直径大于5 μ m的颗粒杂质去除。以往自动化Chelex-100法只处理血痕、烟蒂、毛发、精斑和软骨等生物检材, 但对于载体较大的接触性检材（如棉签拭子和胶带纸）, 工作站在运行过程中会出现机械臂加样枪头堵塞及携带载体的现象[6]。核酸载体分离板（96孔）的应用可以解决上述问题, 从而消除了系统报错或生物样本交叉污染的风险。

本研究实验方法由于仅涉及裂解离心去载体、变性两步, DNA提取、纯化及PCR构建全部流程均可在EVO 150-8自动化工作站上实现, 方法简便、高效, 92份生物检材DNA提取以及PCR构建耗时不超过60 min, 极大地缩短了检验时间。根据本实验室以往的操作经验, 使用手工Chelex-100法一次性处理92份样本, 提取至少需要75 min, 手工PCR构建需要20 min左右。在EVO150-8工作站上使用磁珠法一次性处理92份样本, 整个过程需要128 min[7]（见表2）。

根据现有的研究报道, 在TECAN Freedom EVO150-8核酸提取纯化工作站上使用核酸载体分离板（96孔）, 对于烟蒂、饮料瓶和网线接头类检材, Chelex-100法的检出率较高, 能达到磁珠法的检出率; 但对于手套印、门窗把手以及作案工具类的接触性检材, 其检出率明显低于磁珠法[6]。考虑可能是由于在加Chelex-100裂解液时, 为保证能充分浸没棉签拭子, 裂解液用量至少需要120 μ L, 洗脱体积相对于磁珠法过大, 对于上述微量检材不具有优势。如何改进棉签拭子或者寻求替代品, 以适用体积更小的裂解体系是本实验室进一步的研究重点。

综上所述, 基于核酸载体分离板Chelex-100法的自动化工作站能够较好地解决传统自动化工作站操作过程复杂、运行时间长等问题; 对部分接触性检材DNA的提取不仅准确可靠, 而且更加快速高效。该方法最大限度地降低人为因素带来的错误和质量波动, 促进实验室操作的规范化, 不仅为基层办案赢得宝贵时间, 还能较大程度地减轻DNA检验人员的工作量。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
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