引用本文
马荣梁, 赵雯婷, 薛静, 王子政, 陈子龙. 荧光适配体技术显现手印的初步研究[J].刑事技术, 2017,42(3):178-181
MA Rongliang, ZHAO Wenting, XUE Jing, WANG Zizheng, CHEN Zilong. Preliminary Application of Fluorescent Aptamer to Detect Fingermark[J]. Forensic Science and Technology,2017,42(3): 178-181  
Permissions
Copyright©2017, 《刑事技术》编辑部
《刑事技术》编辑部
荧光适配体技术显现手印的初步研究
马荣梁, 赵雯婷, 薛静, 王子政, 陈子龙
公安部物证鉴定中心,北京100038

第一作者简介：马荣梁（1975—）,男,吉林舒兰人,副研究员,博士,研究方向为指纹显现、手印鉴定。E-mail：marl2013@163.com。

基金资助: 公安部科技强警基础工作专项项目（No.2014GABJC039）
摘要

荧光适配体技术是手印显现的最新热点之一。本文阐述了针对手印物质中广泛存在的溶菌酶,合成结合溶菌酶的单链DNA适配体,并在适配体连接上荧光素制成溶菌酶适配体-荧光素复合物（LBA-FAM）,在适当的条件下,使用LBA-FAM对多种客体上的手印进行显现。显现结果证明：LBA-FAM能够显现多种客体上的手印,尽管手印显现效果有待提高,但事实证明：免疫学及适配体方法为手印显现开辟了一条新的途径。

关键词: 手印显现; 荧光; 适配体; 免疫方法; 溶菌酶
中图分类号:DF794.1 文献标志码:A 文章编号:1008-3650(2017)03-0178-04 doi: 10.16467/j.1008-3650.2017.03.002
Preliminary Application of Fluorescent Aptamer to Detect Fingermark
MA Rongliang, ZHAO Wenting, XUE Jing, WANG Zizheng, CHEN Zilong
Institute of Forensic Science, Ministry of Public Security, Beijing 100038, China
Abstract

Fluorescent aptamer is now being used to develop fingermark, making its application one of the most novel techniques for fingermark detection. This paper describes an original approach to visualize fingermark through an aptamer complex targeting the lysozyme, one protein being universally existed in human sweat. A fluorescent reagent, FAM, is bound on the other end of the newly-born aptamer complex to bring forth an assemblage named as LBA-FAM. A variety of surfaces carrying deposited fingermarks have been tested to detect with LBA-FAM, showing the LBA-FAM has successfully developed fingermarks left on several surfaces. This work proved that immune-plus-aptamer approach is promising for fingermark detection though further efforts should be attempted to improve the effect.

Key words: fingermark detection; fluorescence; DNA aptamer; immune approach; lysozyme

指纹是最古老的法庭科学证据之一, 可直接认定具体个人。指纹具有人各不同、终身不变的特性。随着计算机指纹自动识别系统（Automated Fingerprint Identification System, AFIS)的应用, 指纹在侦查破案中地位更加重要。一般地, 指纹技术可以分为指纹显现技术, 指纹鉴定技术, 计算机指纹自动识别技术三类[1]。指纹显现技术就是指使用物理、化学、生物学等方法使潜在指纹（人眼看不见的指纹）显现为人眼可见的指纹。指纹技术的核心与关键是指纹显现技术的提高。只有指纹显现技术提高了, 从案件现场提取更多的指纹, 才能进行后续的鉴定及使用AFIS进行自动查询, 信息研判和精确打击。随着生物化学技术的发展, 免疫学显现手印技术受到重视。免疫学方法显现手印, 一般也是以荧光物质标记抗体, 与指纹物质中的相应物质（抗原）反应; 或将荧光物质标记二抗, 与一抗进行反应, 最终将指纹显现[1]。近年来, 国内外学者对免疫标记技术在汗潜手印的显现与成分检测的研究主要围绕以下几种组分：氨基酸、蛋白质和多肽（角蛋白、组织蛋白酶、皮离蛋白、人血清白蛋白等）、尼古丁代谢产物（可替宁）、毒品（四氢大麻酚, 美沙酮）及其代谢产物（美沙酮代谢产物EDDP, 吗啡, 苯甲酰芽子碱）等[2]。现在, 适配体（Aptamer）在生物化学领域得到了广泛的应用。适配体是一种单链DNA或RNA, 具有高度的选择性和吸附性, 适配体在生物医学领域的疾病检验诊断及成像方面, 已经逐渐成为一种和抗体反应相抗衡的重要技术。和抗体相比, 适配体具有许多独特的优点及特性：如适配体设计上有更多选择, 对制备环境要求低, 容易改造, 并且生化稳定性更强等。预计在不远的将来, 适配体将有望取代酶联免疫反应, 成为各种化学分子探测的有力武器[3]。在法庭科学领域, Cox等人报道了一种针对溶菌酶（Lysosome）的适配体[4]。溶菌酶是一种在人类汗液中广泛存在的多肽[5]。

本文将绑定溶菌酶的适配体选择为指纹探测试剂并在5’ 端连接羧基荧光素(FAM)作为指纹显色试剂（Lysosome Binding Aptamer-FAM, LBA-FAM）。理论上, LBA-FAM应该对手印物质中的溶菌酶具有高度的选择性和结合性, 结合手印纹线后, 其连接的荧光素在合适的光源激发下, 可发出明亮的荧光从而将手印显现出来。

1 材料和方法
1.1 主要仪器、设备及材料

绑定溶菌酶FAM显色引物（LBA-FAM）：由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

磷酸缓冲液（PBS）：北京索莱宝科技有限公司生产。

免疫组化笔：北京索莱宝科技有限公司生产。

指纹照相装置：DCS照相装置（英国foster-Freeman公司生产, 北京瑞源科技有限公司经销）。

智能恒温恒湿箱：浙江宁波海曙赛福实验仪器厂生产。

1.2 LBA-FAM工作液制备

按说明将1OD的适配体加入磷酸缓冲液配制成储存液, 然后取此储存液加入适量PBS配制成工作液。

1.3 手印制备及显现

1.3.1 手印制备

数人用手指轻轻擦拭额头, 分别在载玻片、塑料、胶带粘面、纸张（复印纸, 牛皮纸, 卡片纸）、铝箔、陶瓷制品、NC及PVDF膜上留手印。手印留待不同时间后进行试验。

1.3.2 手印显现步骤

在客体上使用免疫组化笔将指纹圈起, 然后使用一次性滴管将LBA-FAM工作液滴在手印上面（免疫组化笔的作用是使工作液不外流）。

指纹遗留客体放入适当大小的培养皿中, 用paraffin膜封好并用锡箔纸包装。

检材分成两批, 一批在室温下显现; 另一批在37 ℃摄氏度恒温箱中进行显现。

1.4 照相

使用DCS照相装置, 在470 nm下拍照, 530 nm长通滤色镜, 一般采用较长曝光时间获得指纹图像。

2 结果及讨论
2.1 不同客体上手印显现效果及原因分析

不同客体上的显现效果, 以NC膜上效果最好（图1）。NC膜是蛋白印迹实验的标准固相支持物, 因其为疏水多孔客体, 在低离子转移缓冲液(本实验中使用PBS)的环境下, 大多数带负电荷的蛋白质会与NC膜发生疏水作用而高亲和力的结合在一起。

本实验中, 指纹物质中的溶菌酶会牢固结合在NC膜上, 然后与LBA-FAM高效结合并显现出手印。其次在非渗透性客体上的效果好于渗透性客体（主要为纸张）。

非渗透性客体上, 以锡箔纸上效果最好（图2、3）, 陶瓷制品上效果其次（图4）, 载玻片上效果较差（图5）, 塑料上效果最差, 基本没有荧光显示。

图1 NC膜上的新鲜手印显现效果Fig.1 Fresh fingermark developed on a nitrocellulose filter membrane

图2 锡箔纸1上的遗留时间为一周的手印显现效果Fig.2 One-week-old fingermark developed on an aluminum foil

胶带粘面上指纹（图6）显现效果虽较好, 但其并不是LBA-FAM的荧光效果, 普通胶带粘面上新鲜手印未经LBA-FAM处理, 拍照效果也非常理想。

图3 锡箔纸2上的新鲜手印显现效果Fig.3 Fresh fingermark developed on an aluminum foil

图4 瓷砖上的新鲜手印显现效果Fig.4 Fresh fingermark developed on a porcelain tile

图5 载玻片上的新鲜手印显现效果Fig.5 Fresh fingermark developed on one glass slide

图6 胶带粘面上的新鲜手印显现效果Fig.6 Fresh fingermark developed on the sticky side of an adhesive tape

据文献报道, 载玻片上也能显现出理想手印[7], 但我们在实验中反复测试, 显现效果仍不理想。在非渗透性客体上, 由于显现时使用水溶液, 溶菌酶无法像在NC膜上那样牢固结合, 估计会有较大一部分手印中的溶菌酶溶解于水而损失掉, 从而导致非渗透客体上指纹显现效果较NC膜差。溶菌酶为蛋白质, 溶解于水, 所以, 对普通复印纸上的手印, 采用37 ℃ 10~20 s显现, 而避免长时间反应, 否则指纹会在水溶液中扩散。

此外普通复印纸在蓝绿光下也发出强烈的荧光, 会导致纸张显现效果不理想（图7）, 经Photoshop图像软件处理后（PSV分割算法处理）, 效果有所增强（图8）, 但仍然比文献记载差[6]（图9）。

卡片纸在蓝绿光激发下荧光非常强烈, 另外因本实验采用水相溶液显现, 手印物质在卡片纸上扩散较快, 故导致无法观察到手印显出。而牛皮纸上手印物质虽然扩散较慢, 但牛皮纸质地粗糙, 故也无法观察到手印。

图7 普通复印纸上的新鲜手印显现效果Fig.7 Fresh fingermark developed on one copy paper

图8 普通复印纸上的新鲜手印显现效果（经图像处理软件处理）Fig.8 Fresh fingermark developed on one copy paper and followed to process by Photoshop software

图9 额头上蹭过的新鲜手印处理后的指纹显现效果[6]Fig.9 Literature-reported result for a fresh fingermark to develop[6], one visualization at similar condition and treatment to the Fig.8’ s.

2.2 手印遗留时间影响

对一般客体上的新鲜（本文定义为遗留时间在24 h之内）及陈旧（本文定义为遗留时间超出24 h）手印显现效果：

NC膜上的手印, 效果影响不大; 锡箔纸上的手印, 似乎有一定影响：如新鲜手印（图3）显现效果似乎较陈旧手印（图2）为好。

而对其他客体上的手印, 由于新鲜手印显现效果较不理想, 故难以比较新鲜手印与陈旧手印效果区别。

2.3 显现方法优化

免疫学反应对反应条件要求较为苛刻, 因此实验方法的优化至关重要。

2.3.1 显现温度及时间

根据文献描述, 37 ℃短时间处理较之于长时间低温（室温）处理效果更好[6]。实验中, 我们采用两种显现方式, 37 ℃ 1 h至1 d处理和室温下1 h至3 d。室温下, 随显现时间延长, 效果逐渐提高, 但显现时间超过24 h后指纹效果未见明显提高, 反而背景加深, 导致指纹模糊。在37 ℃下, 1 h效果较好, 显现时间延长后并无明显提高; 超过2 h后背景荧光较强。文献记载, 手印显现温度超过40 ℃, 适配体将会失活, 故本实验中设定温度为37 ℃。

2.3.2 PBS洗脱

据报道, 实验中使用PBS洗脱会降低背景荧光[7]。但我们在实验中发现, 一般不应进行洗脱, 因适配体与指纹物质结合力较差, 洗脱后会造成LBA-FAM从指纹物质上脱落; 即将工作液从手印上轻轻甩去并等待手印完全干燥即可。

根据上述结果, 本实验指纹显现条件设定为：37 ℃、1 h孵化后, 将工作液从手印上去掉, 等待手印完全干燥, 在470 nm激发, 530 nm长波通透观察。

3 结论

综上所述, 我们认为荧光适配体技术显现手印是一种可行的方法, 但将来仍需进一步优化实验条件, 并针对手印中不同物质成分合成相应的适配体, 进一步探索提高显现效果。下一步工作拟在以下方面进行：

1）针对手印中其他成分进行显现, 并探索最佳显现条件, 提高结合能力, 实现精确应对。

2）连接效率更高的荧光或显色标签, 提高手印显现效果。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
[1] 马荣梁, 赵越, 高峰, 等. 指纹显现技术的发展方向[J]. 刑事技术, 2016, 41(2): 64-69. [本文引用:1]
[2] 汤凤梅, 马荣梁, 冯永杰, 等. 免疫标记法在汗潜手印的显现与成分检测中的应用进展[J]. 中国司法鉴定, 2015(4), 89-94. [本文引用:1]
[3] TAN W, DONOVAN M J, Jiang J. Aptamers from cell-based selection for bioanalytical applications[J]. Chemical reviews, 2013, 113(4): 2842-2862. [本文引用:1]
[4] COX JC, ELLINGTON AD. Automated selection of anti-protein aptamers[J]. Bioorg Med Chem, 2001, 9(10): 2525-2531. [本文引用:1]
[5] HARTZELL-BAGULEY, BRITTANY, et al. Chemical composition of latent fingerprints by gas chromatography-mass spectrometry. An experiment for an instrumental analysis course[J]. J Chem Educ, 2007, 84(4): 689. [本文引用:1]
[6] WOOD M. A novel approach to latent fingermark detection using aptamer-based reagents [D]. Sydney: University of Technology Sydney, 2014: 170-206. [本文引用:2]
[7] WANG J, WEI T, LI X, et al. Near-Infrared-Light-Mediated Imaging of Latent Fingerprints based on Molecular Recognition. Angew Chem, 2014, 126: 1642-1646. [本文引用:1]