男性血液采集卡（长春博坤经典型血样采集卡）样本184份, 来自秦城DNA建库平台的日常建库样本; 男性样本唾液采集卡70份, 来自长春市公安局, 系违法犯罪人员数据库样本。同一男性尸源的血斑、心、肝、脾、肺、肾等组织提取的DNA; 实验室日常检案积累的各类案件检材DNA样本80份, 来自骨骼样本、矿泉水瓶擦拭物、滤纸血痕、血痕布片、棉签、唾液斑、口腔拭子。大猩猩、狐猴、猪、雪貂、兔、牛、犬、酵母和大肠杆菌的 DNA 样本, 其中部分样本由中国医学科学院动物研究所提供, 部分样本为实验室收集。

本文实验操作按DNATyper^TMY24检测试剂盒说明进行, 使用eppendorf PCR仪扩增、美国AB公司的3500xL测序仪进行毛细管电泳检测, 之后用GeneMapper ID-X分析数据, Peak Detection 分析的阈值设为50。

1.3.1 不同扩增体系测试

分别采用5、10、25 μ L扩增体系对1 ng 2800 M标准品扩增, 进行检验并重复1次。

1.3.2 不同引物量测试

分别以1 ng 2800M标准品为模板, 扩增系统中采用0.5× 、1× 、2 × 的引物量进行检验, 平行测试两次。

1.3.3 退火温度的测试

设置扩增程序中的退火温度分别为55、57、59、61、63 ℃, 检验1 ng 2800M标准品并重复1次。

1.3.4 不同循环次数测试

分别设置扩增程序中的循环次数为24、26、28、30、32次, 检验1 ng 2800M标准品并重复1次。

1.4.1 准确性及一致性

分别使用DNATyper^TMY24（五色荧光标记）及AmpFlSTR^® Yfiler^® plus试剂盒（美国AB公司, 六色荧光标记）对同一组样本（92份男性血液采集卡）进行检验, 以验证试剂盒分型的准确性。并使用DNATyper^TMY24试剂盒对同一个体的血斑、心、肝、脾、肺、肾等组织提取的DNA进行检测, 以验证试剂盒对不同组织来源样本分型的一致性。

1.4.2 均衡性

用DNATyper^TMY24试剂盒对1 ng2800标准品分别进行3组扩增, 统计DYS527ab和DYS385ab这两个基因座的等位基因间的均衡性、同一荧光标记的不同基因座之间均衡性以及不同荧光标记物之间的均衡性。

1.4.3 灵敏度测试

分别以1.0、0.5、0.25、0.125、0.0625 ng的2800M标准品为模板, 用DNATyper^TMY24试剂盒进行检验并各重复1次。

1.4.4 稳定性

采用同一批次的DNATyper^TMY24试剂盒（批号为1601）在公安部物证鉴定中心及长春市公安局实验室对同一组唾液卡样本（70份）进行检测, 验证试剂盒对不同实验环境的适用性; 选取生产时间为2015年10月和2016年6月, 批号为1504和1602这两个批次试剂, 分别检验同一组男性样本（92 份）, 以验证不同批次试剂盒的稳定性。将试剂盒各个组分分别反复冻融5~20次后进行检验, 分别包括引物混合物、PCR扩增缓冲液、分子内标及等位基因分型标准物（ladder）等, 验证试剂盒中各组分的稳定性。

1.4.5 耐受性

分别在标准PCR反应体系中加入血红素, 使其终浓度分别为5、20、40 μ mol/L, 以测试DNATyper^TMY24试剂盒的耐受性。

1.4.6 种属特异性测试

扩增雄性大猩猩、狐猴、猪、雪貂、兔、牛、犬, 以及酵母、大肠杆菌的DNA样本, 以测试DNATyper^TMY24试剂盒的种属特异性。

1.4.7 混合样本测试

将1 ng 2800 M标准品分别按1꞉1000、1꞉2000、1꞉3000、1꞉4000的比例加入高浓度的9947A, 作为模板扩增检测, 各重复一次。

1.4.8 常见案件检材检测

用DNATyper^TMY24试剂盒和AmpFlSTR^® Yfiler^® 试剂盒对80份实验室积累的各类常见案例检材DNA进行检验。

DNATyper^TMY24试剂盒中25个基因座分布见图1, 试剂盒包括了AmpFlSTR^® Yfiler^® 试剂盒中的17个基因座（DYS19、DYS385a/b、DYS389I/II、DYS390、DYS456、DYS458、DYS635、Y GATA H4、DYS438、DYS391、DYS392、DYS393、DYS437、DYS448、DYS439）以及7个符合中国人群遗传特征的Y-STR基因座(DYS460、DYS447、DYS527a/b、DYS444、DYS522、DYS617)^{[8, 9, 10]}, 另外还包括一个性别鉴定基因Amel。试剂盒中的等位基因分型标准物（ladder）见图2, 包括了中国人群中常见的等位基因, 分型准确、图谱清晰。

图1

Fig.1

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图1 DNATyperTMY24直扩试剂盒中基因座分布Fig.1 The loci distribution of DNATyperTM Y24 kit

图2

Fig.2

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图2 DNATyper Y24直扩试剂盒中ladder图谱Fig.2 The ladder profile from alleles of DNATyperTM Y24 kit

2.2.1 扩增体系测试

用5、10、25 μ L 等3种不同扩增体积, 分型结果一致, 并且随着扩增体积增大, 峰值呈减弱趋势（图3）。比较显示, 5 μ L体系效果也不错, 但是体系太小容易被蒸干, 或者出现丢峰现象。10 μ L体系比较适宜, 峰的高度足够而且各个荧光标记颜色之间的平衡性比较好。与10 μ L体系相比, 25 μ L体系中峰高有所降低, 在200~1000之间, 并且在90 bp之前出现了一个stutter峰, 虽然不影响基因的判读, 但在分析数据时仍需注意, 所以最推荐的扩增体系是10 μ L体系, 性价比也最高。

图3

Fig.3

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图3 不同扩增体积检测结果Fig.3 The electrophoretogram under different PCR reaction volumes

2.2.2 引物加入量测试

应用0.5× 、1× 、2× 等3种不同引物量对1 ng 2800M标准品进行扩增, 其中0.5× 引物量的峰值（RFU）在200~2000之间, 1× 引物量峰值在400~2000之间, 2× 引物量峰值在700~2300之间, 并且随着引物加入量的增大, 峰值也增强。比较图4中结果, 1× 引物量比较合适, 可以在保证检出的同时有效节约成本。

图4

Fig.4

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图4 不同引物量检测结果Fig.4 The electrophoretogram with different dosages of primers

2.2.3 退火温度测试

设定从55 ℃到63 ℃的5种不同退火温度, 结果见图5。其中55 ℃部分基因座出现非特异stutter峰, 随着退火温度的增加, stutter峰逐渐降低直至消失, 但是退火温度提高到63 ℃, 出现部分等位基因丢失（图中圆圈所示）, 因此, 在使用该试剂盒的时候设置退火温度为57~61 ℃之间即可, 一般建议设置退火温度59 ℃, 可以在保证不丢峰的同时防止非特异峰的出现。

图5

Fig.5

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图5 不同退火温度检测结果Fig.5 The electrophoretogram under different annealing temperatures

2.2.4 循环次数测试

设定扩增的循环参数从24次到32次, 扩增结果见图6。其中循环次数为24次时, 部分基因座峰值太低而无法标记; 其余循环次数得到完整分型, 并且分型结果一致。但由于30次以上循环的峰值较大, 在10 000以上, 容易产生渗透峰, 所以一般设置循环次数为26~28次, 样本质量较差时, 扩增出的峰值比较低, 可增加至30次。

图6

Fig.6

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图6 不同循环次数检测结果Fig.6 The electrophoretogram with different PCR cycles

2.3.1 准确性及一致性

分别使用DNATyper^TMY24及AmpFlSTR^® Yfiler^® plus试剂盒对92份男性血液采集卡进行检测, 均获得完整分型结果、图谱清晰, 且两个试剂盒在共有的18个Y-STR位点上的分型一致; 用DNATyper^TMY24试剂盒对同一个体的各个组织DNA检测, 分型结果一致, 表明DNATyper^TMY24试剂盒可以适用于不同组织且能准确判定基因型。

2.3.2 均衡性

统计试剂盒中各个基因座的峰值, 同一基因座的等位基因间均衡性均大于90 %, 即DYS385a/b和DYS527a/b的等位基因间均衡性大于90 %; 而同一颜色荧光标记物的基因座均衡性均大于70 %; 不同荧光标记物间, 蓝色荧光标记物峰值最高, 红色荧光标记物的峰值最低, 是由于3500xL测序仪的激发光源波长与红色荧光标记物的吸收波长相距较远导致的。据统计, 不同荧光标记物间的均衡性大于50 %, 表明DNATyper^TMY24试剂盒具有良好的均衡性。

2.3.3 灵敏度

5种标准品浓度检验结果如图7所示, 当模板量为0.0625 ng时, DYS391位点因为峰较低而标记不上出现等位基因丢失, 而在0.125 ng以上的标准品都可以得到完整分型, 表明本试剂盒的检出限可以低至0.125 ng。

图7

Fig.7

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图7 试剂盒灵敏度检测Fig.7 The electrophoretogram with various amounts of template DNA

2.3.4 稳定性

用同一批次的试剂盒在公安部物证鉴定中心和长春市公安局实验室对同一组血卡样本（70份）进行检测, 分型结果一致, 且全部检出。另外, 长春市公安局实验室应用该试剂盒检测了587份唾液卡样本, 检出率在90 %以上, 表明试剂盒可以适应不同实验室条件。用2个不同批次的试剂盒对同一组样本（92份）的检测, 结果表明试剂盒的各批次产品质量稳定; 试剂盒中各个组份经反复冻融多次, 扩增后检验发现并无明显变化, 表明试剂盒中各组分质量稳定。综合上述实验, 表明DNATyper^TMY24试剂盒稳定性良好。

2.3.5 耐受性测试

在标准反应体系中加入血红素, 血红素终浓度在10 μ mol/L时, DNATyper^TMY24试剂盒检测1 ng 2800标准品仍可获得完整分型; 而当血红素终浓度大于10 μ mol/L, 不能获得完整分型, 并且个别基因座还出现双肩峰。表明DNATyper^TMY24试剂盒具有一定的抗抑制能力, 对一定浓度的血红素具有耐受性, 但仍需要注意抑制剂的影响, 比如扩增FTA卡时, 水洗后再扩增效果更佳。

2.3.6 种属特异性

对本文选择的动物样本、酵母及大肠杆菌DNA样本进行检测, 结果大猩猩样本在80~120 bp、350~370 bp区段有非特异峰, 狐猴样本在80~100 bp有非特异的OL峰, 所以需要注意大猩猩和狐猴等的影响, 而其他动物样本没有非特异峰（图8）。

图8

Fig.8

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图8 不同种属DNA模板的检测结果Fig.8 Genotyping with various amounts of species DNA

2.3.7 混合样本检测效果

当2800M꞉9947A为1꞉1000时, 在大量女性成分的干扰下仍然可以准确获得2800分型, 而当男女混合比例小于1꞉1000时, Y-STR的分型受到女性成分干扰。

2.3.8 常见案件检材测试

用DNATyper^TMY24试剂盒和AmpFlSTR^® Yfiler^® 试剂盒对80份实验室积累的各类常见案例检材DNA进行检验。经检验, 结果显示DNATyper^TMY24试剂盒对案件检材具有良好的检出效果, 检出能力并不低于进口试剂（图9）。

图9

Fig.9

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图9 骨骼样本检测的电泳图谱Fig.9 The electrophoretogram of ossature

DNATyper^TMY24试剂盒保留了17个通用基因座, 便于DNA数据的交流与共享, 又选择在中国人群中具有较好多态性的基因座DYS447、DYS522、DYS444、DYS460、DYS617及DYS527a/b, 尤其是DYS447和DYS527a/b在中国人群中的GD值大于0.8^[11], 具有较高的分辨能力, 更适用于中国人群。此外, 该试剂盒包含了Amel性别基因座, 一旦出现检测样本性别标识错误、男性Y染色体缺失等情况而导致样本未检出, Amel基因座可为我们有效甄别样本未检出的原因。

综上, 本文对DNATyper^TMY24试剂盒进行了方法学验证和技术指标测评, 结果表明该试剂盒的推荐扩增条件为10 μ L体系, 1× 引物量, 59 ℃退火温度, 28次循环。试剂盒的准确性、一致性、种属特异性均良好; 检出限可以低至0.125 ng; 不同批次试剂质量稳定, 对骨骼、血痕、唾液斑等不同常见检材有较好的适应性, 在技术指标方面该试剂盒符合DNA检测试剂的标准, 可适用于建库、案件排查以及案件检材提取的DNA。

DNATyper^TMY24是国内自主研发试剂盒, 可为我国Y-STR检验、Y数据库建设以及Y家系排查提供有效的技术方案。在中国广大农村地区, 仍保留家族式聚居方式, 因此建立在家系基础上的Y染色体家系排查已经成为了破案的新手段, 为多起重大要案破获提供了非常重要的指向性线索。可以预见, 将来“ Y-STR家系排查法” 以及建立在家系图谱基础上的Y数据库将发挥越来越重要的作用。DNATyper^TMY24试剂盒可以直接扩增各种纸质载体的数据库样本, 简化了操作流程, 减少了样品污染的机会, 降低家系排查及Y库建设的成本, 保障了DNA数据库的安全, 产生良好的社会效益。