引用本文
苏艳佳, 吴微微, 郝宏蕾, 任文彦. 二组分混合样本重叠等位基因拆分研究[J].刑事技术, 2017,42(2):137-140
SU Yanjia, WU Weiwei, HAO Honglei, REN Wenyan. Separating the Overlapping Alleles from STR Genotyping of Two Donors’ Mixture[J]. Forensic Science and Technology,2017,42(2): 137-140  
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二组分混合样本重叠等位基因拆分研究
苏艳佳, 吴微微, 郝宏蕾, 任文彦
浙江省公安物证鉴定中心 浙江省刑事科学技术应用研究重点实验室,杭州 310009

第一作者简介：苏艳佳（1982—）,女,福建晋江人,学士,工程师,研究方向为法医物证鉴定。E-mail:yvonne0960@163.com

摘要

目的 对二组分混合样本来源于杂合子的重叠等位基因拆分进行粗浅分析。方法 模拟男女二组分混合样本,制备007和9947A模板DNA量比例为1꞉1、2꞉1、5꞉1的混合样本,采用Identifiler Plus试剂盒复合扩增,观察8个均来源于杂合子的重叠等位基因峰高比值变化率。结果 混合STR分型中,来源于杂合子的重叠等位基因其峰高比值变化率在16.65%以上时,拆分较为确定。结论 来源于两个体的混合STR分型,在已知其中一个STR分型的前提下,可通过计算等位基因峰高比值变化率对二峰和三峰进行初步拆分,尽可能多地获得另一个体的STR分型数据,从而为侦查排查、数据库比对和人员认定提供依据。

关键词: 法医物证学; 混合生物样本; 阈值
中图分类号:DF795.2 文献标志码:A 文章编号:1008-3650(2017)02-0137-04 doi: 10.16467/j.1008-3650.2017.02.012
Separating the Overlapping Alleles from STR Genotyping of Two Donors’ Mixture
SU Yanjia, WU Weiwei, HAO Honglei, REN Wenyan
Institute of Forensic Science, Zhejiang Provincial Public Security Bureau & Zhejiang Key Laboratory of Forensic Science and Technology, Hangzhou 310009, China
Abstract

Objective To separate the overlapping alleles from STR genotyping of the mixture of two donors who are of genetically heterozygous.Methods The 007 and 9947A samples, usually used of DNA positive controls, were chosen as the unrelated male/female mixed sample for this study. Mixtures were prepared by 007 to be blended with 9947A in ratios of: 1:1, 2:1, and 5:1. The mixed DNA was amplified by IdentifilerTM Plus kit. The variance ratio was calculated from the peak heights of overlapping alleles which were of two donors.Results When the average variance ratio is above 16.65% of the peak heights of overlapping alleles, the separating can be surely carried out to obtain the true identity of donor.Conclusion The minor donor can be separated from a mixture by calculating the variance ratio of peak heights of alleles from the primary donor. The handling method in this paper can be provided as a reference for criminal investigation, database searching and individual identification.

Key words: forensic biological evidence; mixed biological sample; threshold value

在各类刑事案件中, 提取的现场物证常染色体STR常检出混合分型, 且多数混合分型来源于受害人和嫌疑人。在无明确嫌疑对象的情况下, 对混合STR分型进行拆分就显得非常重要。如何最大程度的获得来源于嫌疑对象的STR分型数据, 用于人员排查和数据库比对, 这一直是混合STR数据分析的重点和难点。本文通过实验模拟二组分混合样本, 观察来源于杂合子以及在混合STR分型中表现为三峰或二峰的重叠等位基因峰高比值率的变化, 探讨分型拆分阈值, 从而为来源于两个个体的常染色体混合STR分型的拆分和判型提供参考。

1 材料与方法
1.1 实验材料和仪器

浓度均为2 ng/μ L的对照品007和9947A DNA样品（美国Thermo Fisher公司）, 其中007分型作为参考数据, 9947A作为混入样品; 9700型PCR扩增仪、3500xL型基因分析仪（美国Thermo Fisher公司）; 主要试剂：IdentifilerTM Plus试剂盒（美国Thermo Fisher公司）。

1.2 方法

1.2.1 灵敏度检验

制备浓度为2.0、1.0、0.5、0.1 ng/μ L的对照品007用于最佳扩增量测试, 浓度为40.0、50.0、60.0 pg/μ L的对照品9947A用于灵敏度检验, 各浓度各平行扩增5次。

1.2.2 检出下限的检验

在007最佳扩增量（1 ng）的基础上, 结合9947A的检测灵敏度（50 pg）, 制备007与9947A比例分别为1꞉1（1000 pg꞉1000 pg）、5꞉1（1000 pg꞉200 pg）、10꞉1（1000 pg꞉100 pg）、20꞉1（1000 pg꞉50 pg）的混合样本作为扩增模板, 各梯度各平行扩增5次, 用于测定007与9947A混合样本中较少组分检出下限。

1.2.3 梯度平行扩增

在007和9947A混合样品中较少组分检出下限（10꞉1）基础上, 以007与9947A比例分别为1꞉1（1000 pg꞉1000 pg）、2꞉1（1000 pg꞉500 pg）、5꞉1（1000 pg꞉200 pg）的混合样本作为扩增模板, 各梯度各平行扩增50次。同时以1000 pg的007进行20次平行扩增的数据作为计算参考。

1.3 PCR扩增、检测及分析

复合扩增及产物的分离与检测参照文献[1]。采用10 μ L扩增反应体系, 28个循环, DNA模板量均为1 μ L。

1.4 计算推断方法

以对照品007的最佳扩增量1 ng进行扩增, 检测获得的STR分型中重叠等位基因和参考等位基因的峰高比值（设为x）为基础, 观察计算007和9947A以各个比例组成的二组分混合STR分型中, 各个重叠等位基因和参考等位基因的峰高比值(设为y)的变化率, 计算式为： (y-x)/x。

2 结 果
2.1 灵敏度检测结果

根据文献[2]中分型结果的基本要求, 观察5次平行扩增的检测结果, 本文中007的最佳检测量为1 ng, 9947A的灵敏度为50 pg。

2.2 007和9947A混合样品中较少组分下限检测结果

当007和9947A的DNA模板比为1꞉1时, 两样品产物峰高接近; 随着混合样品中9947A所占比例逐步减少, 两样品产物峰高差相应增大。当比例降为10꞉1时, 9947A在扩增片段较长的几个基因座等位基因消失, 同时短片段的优势扩增明显; 当比例降低到20꞉1时, 9947A的各个基因座分型基本无法检出, 只获得007的基因型。这与文献报道[3, 4]基本一致。

2.3 混合样品分析和判型

007和9947A组成的混合STR分型中（见表1）, 均来源于杂合子的重叠等位基因共有8个, 分别来自CSF1PO、D3S1358、TH01、D2S1338、D18S51、FGA、D19S433等7个基因座。根据电泳原理, 同一个基因座或同一荧光染料、最邻近基因座的电泳行为最为相似, 具有可比性。据此, 选取同一基因座或同一荧光染料、最临近基因座中无重叠现象的等位基因作为参考等位基因进行峰高比较。其中CSF1PO、D3S1358、TH01、D2S1338、D18S51、FGA参考等位基因选用同一基因座且无重叠的等位基因; D19S433等位基因14、15同时被重叠, 选用同一荧光染料、最临近的vWA基因座中无重叠的等位基因14作为参考等位基因。分别计算上述8个重叠等位基因与参考等位基因的峰高比值、峰高比值变化率, 结果见表2。本文认为16.65 %可作为判断重叠等位基因的参考阈值。

表1 007、9947A以及两者混合STR分型 Table 1 The STR genotypes of 007, 9947A and their mixture
表2 007和9947A各比例混合样本中重叠等位基因与参考等位基因的峰高比值及峰高比值变化率（n=50) Table 2 The ratio and variance ratio of peak heights from the overlapping alleles mixed with 007 and 9947A at different proportions (n=50)
3 案例应用

2013年12月某日温州市发生一起凶杀案, 提取死者指甲上斑迹、死者血样等检材检验, 其中死者左手食指指甲上斑迹获得混合STR分型（见图1）, 其余未获得有效分型。利用本研究的拆分方法, 结合死者血样STR分型（见图2）, 对该混合STR分型进行拆分（见表3）, 最大程度地获得除死者以外的1个STR分型, 并在DNA数据库中迅速比中一名违法犯罪人员, 从而为侦查提供方向和依据, 案件成功告破。

图1 死者左手食指指甲上斑迹的STR分型谱带Fig.1 STR profile of the stain on the deceased’ s left-hand index finger nail

图2 死者血样的STR分型谱带Fig.2 STR profile of the deceased’ s blood sample

表3 混合样本中重叠等位基因与参考等位基因的峰高比值及峰高比值变化率 Table 3 The ratio and variance ratio of peak heights from the overlapping alleles of mixed biological samples
4 讨 论

实际检案中碰到的二组分混合STR分型中, 一般表现为一、二、三、四峰。已知其中一个STR分型的前提下, 对此类混合STR分型的拆分, 难点在对二峰、三峰的拆分, 本文主要对此进行讨论。讨论时将混合STR分型中二峰和三峰分成两种情况：来源于杂合子的重叠等位基因、来源于纯合子的重叠等位基因。

007和9947A组成的混合STR分型中, 有2个来源于纯合子的重叠等位基因：分别为D8S1178（13）, D21S11（30）。该2个等位基因均为纯合子叠加后形成的混合分型, 因纯合子峰型较高, 峰高比值变化率显著高于叠加了杂合子等位基因, 容易判定, 或者在混合STR分型图谱中易表现为平头峰, 峰高比值变化率不呈线性正相关, 本文不予以讨论。

本文着重讨论了007和9947A组成的混合STR分型中8个来源于杂合子的重叠等位基因, 分别来自CSF1PO、D3S1358、TH01、D2S1338、D18S51、FGA、D19S433等7个基因座。8个重叠等位基因的峰高比值变化率随着混合物中9947A量的递减而逐渐变小, 在007和9947A比例为1꞉1时平均值为77.36 %, 2꞉1时为35.82 %, 5꞉1时为16.65 %, 本文认为16.65 %可作为判断重叠等位基因的参考阈值, 且适用于不同扩增片段长度的基因座。以本文讨论的基因座为例, D3S1358、D19S433扩增片段均小于150 bp; 而CSF1PO、D2S1338扩增片段均大于300 bp。

综上所述, 本文获得的混合分型中等位基因峰高比值变化率16.65 % 可以作为二组分均来源于杂合子等位基因叠加的判断依据。在实际检案中, 检见峰的数量小于4的混合斑分型, 在已知其中一个STR分型的前提下, 以等位基因峰高比值变化率16.65 %初步拆分二峰和三峰STR分型, 尽可能多地获得另一个体的STR分型数据, 从而为侦查排查、数据库比对和人员认定提供依据。实际检案中对可疑混合分型的拆分, 尽可能进行多次平行扩增（建议3次以上扩增）, 以减少随机扩增因素对结果研判的影响, 同时还要考虑较少组分样本DNA的量少, 或混合杂质等因素, 进行综合分析, 为案件侦破提供更多的证据与线索。

本文在制备混合样本前, 做了对照品007的最佳扩增量和9947A的灵敏度检测, 以及007和9947A混合样品中较少组分下限检测。根据前述三项检测的结果, 在峰高比值变化率阈值的实验中, 混合样本中的DNA模板总量均小于2 ng, 且较少组分9947A的模板量均在50 pg之上, 从而使STR峰高与该组分在混合样本中的比例相关[5], 且排除了由于较少组分模板用量低于灵敏度而导致阴性结果的可能。

另外, 本文选用阳性对照品007和9947A, 定量准确、模板DNA质纯, 使检验过程中受抑制因素和定量不准确等因素影响较小, 且007和9947A的STR分型均为已知, 不仅可以验证检验结果的准确性, 还便于计算峰高比值变化率。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
[1] 苏艳佳, 吴微微, 郝宏蕾, 等. AGCU Mini系统在法医学中的应用[J] . 中国法医学杂志, 2012, 27(32): 19-221. [本文引用:1]
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[5] SAMBROOK J, RUSSELL DW. In vitro amplification of DNA by the polymerase chain reaction[M]. Molecular Cloning. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001. [本文引用:1]