引用本文
佘彩蒙, 杜鸿雁, 王芳琳, 何洪源, 王小宝. 超高效液相色谱-串联质谱法检测全血中的东莨菪碱和阿托品[J].刑事技术, 2017,42(2):133-136
SHE Caimeng, DU Hongyan, WANG Fanglin, HE Hongyuan, WANG Xiaobao. Determination of Scopolamine and Atropine in Whole Blood by Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry[J]. Forensic Science and Technology,2017,42(2): 133-136  
Permissions
Copyright©2017, 《刑事技术》编辑部
《刑事技术》编辑部
超高效液相色谱-串联质谱法检测全血中的东莨菪碱和阿托品
佘彩蒙1, 杜鸿雁2,*, 王芳琳2, 何洪源1, 王小宝3
1.中国人民公安大学,北京100038
2.公安部物证鉴定中心,北京100038
3.广州市公安局越秀区分局刑警大队,广州 510080
* 通讯作者：杜鸿雁（1980—）,女,山西太谷人,博士,研究员,研究方向为毒物分析。E-mail:dhywind@gmail.com

第一作者简介：佘彩蒙（1991—）,男,北京人,硕士研究生,研究方向为毒物分析。E-mail:1406103243@qq.com

基金资助: 国家自然科学基金项目（81273346）
摘要

本文旨在建立一种基于超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）检测全血中的东莨菪碱和阿托品的快速检验方法。全血样品经乙腈沉淀蛋白,振荡、离心提取后,上清液过0.22μm有机滤膜,上机检测。UPLC-MS/MS检测方法选用Agilent Eclipse Plus C18色谱柱,以0.1%甲酸水溶液-乙腈为流动相,进行梯度洗脱,流速为0.4mL/min。东莨菪碱和阿托品在1~100ng/mL范围内线性良好,线性系数分别为0.9997、0.9968,平均回收率分别为93.99%、97.71%,日内与日间精密度均小于10%。东莨菪碱与阿托品的最低检出限(LOD S/N=3）均为0.2ng/mL,最低定量限（LOQ S/N=10）均为1ng/mL。该方法快速简便,灵敏度高,可用于人全血中东莨菪碱与阿托品的定性定量检测。

关键词: 东莨菪碱; 阿托品; 液相色谱-质谱联用; 快速检验
中图分类号:DF795.1 文献标志码:A 文章编号:1008-3650(2017)02-0133-04 doi: 10.16467/j.1008-3650.2017.02.011
Determination of Scopolamine and Atropine in Whole Blood by Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry
SHE Caimeng1, DU Hongyan2,*, WANG Fanglin2, HE Hongyuan1, WANG Xiaobao3
1. People’s Public Security University of China, Beijing 100038, China
2. Institute of Forensic Science, Ministry of Public Security, Beijing 100038, China
3. Criminal Police Brigade of Yuexiu Branch of Guangzhou Public Security Bureau, Guangzhou 510080, China
Abstract

A novel and rapid method was established for the determination of scopolamine and atropine in human blood by ultra-performance liquid chromatography-mass spectrometry (UPLC-MS/MS). Human blood samples were precipitated with acetonitrile, vibrated and centrifugated. The obtained supernatant was filtered with a 0.22 μm organic membrane for detection. Gradient elution was conducted on an Agilent Eclipse Plus C18 column. The mobile phase, consisted of 0.1 % formic acid aqueous solution and acetonitrile, was flowing at a rate of 0.4 mL/min. The column oven was maintained at 40 ℃. The detection for scopolamine and atropine was linear from 1 to 100 ng/mL with their linear coefficients of 0.9997 and 0.9968. Precision and accuracy were acceptable at any quality control level and the respective average recoveries were 93.99% and 97.71%. The limits of detection (LOD S/N = 3) of scopolamine and atropine were all 0.2 ng/mL. The lowest limit of quantification (LOQ S/N = 10) was 1 ng/mL. The method is sensitive, very fast, easy to perform, and cheap as it only requires deproteinization of blood sample with acetonitrile, therefore suitable to be used for identification and quantification of scopolamine and atropine in human whole blood.

Key words: scopolamine; atropine; liquid chromatography-mass spectrometry; rapid detection

东莨菪碱（scopolamine, Scop）和阿托品（atropine, ATR）分子式分别为C17H21NO4、C17H23NO3, 化学结构式如图1、图2。两种物质均是曼陀罗、天仙子、颠茄等茄科有毒植物的主要有毒成分[1]。此类植物常被作为中草药服用, 也常被泡入酒中作药酒饮用, 服用者常因用药不当、过量服用导致中毒, 中毒者会出现谵妄、幻觉等精神症状, 并有口干、皮肤潮红、瞳孔散大、心跳快、烦躁不安, 严重者昏迷、痉挛, 乃至死亡[2]。由此引发的案件也随之增加, 建立一种简单快速准确的检测方法成为解决此类案件的迫切需要。目前的检测方法主要有高效液相色谱法[3, 4, 5]、高效液相色谱串联质谱法（LC-MS/MS）[6, 7, 8, 9, 10]、毛细管电泳法[11, 12]、气相色谱-质谱联用法[13]等。本文在此基础上建立了一种超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）检测全血中的东莨菪碱和阿托品的快速检测方法, 以满足实际办案中的定性、定量检测需求。

图1 东莨菪碱的分子结构式Fig.1 Molecular structure of scopolamine

图2 阿托品的分子结构式Fig.2 Molecular structure of atropine

1 实验部分
1.1 仪器、试剂与材料

AB API QTRAP5500 质谱仪（美国Applied Biosystems 公司）, 超高液相色谱仪 Shimadzu 30A-LC（日本 Shimadzu 公司）, 乙腈（LC-MS级, 美国Fisher公司）; 甲酸（LC-MS级, 西班牙Fisher公司）, 去离子水（Milli-Q 纯水系统制备, 美国Milillipore公司）。

空白血样：取自北京复兴医院。

东莨菪碱标准品（中国药品生物制品鉴定所, 100476-200301）, 阿托品标准品（美国Cerilliant公司, FN111011-03）, 将两种标准品用乙腈分别精确配制成1.0 mg/mL储备液, 置于-20 ℃冰箱中储存, 使用时将两种目标物混合稀释成100.0、10.0、1.0 ng/mL工作液。

1.2 样品前处理

取0.5 mL空白检血, 添加100 μ L东莨菪碱与阿托品混合标准品溶液, 并加入1.9 mL乙腈, 振荡5 min充分混匀。8 000 r/min离心10 min。取上清液经0.22 µ m有机膜过滤, 取滤液一定量置于进样瓶中, 供LC-MS/MS分析。

1.3 色谱条件

选用Agilent Eclipse Plus C18（2.1 × 100mm、1.8μ m）色谱柱; 柱温：40 ℃; 流动相(A):0.1 %甲酸水, 流动相(B):乙腈; 进样量2 μ L; 流速为0.4 mL/min梯度洗脱, 梯度洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱条件 Table 1 Gradient elution conditions
1.4 质谱条件

采用电喷雾离子源（ESI+）, 在正离子扫描模式下检测, 扫描模式为多反应离子检测（MRM）; 离子源电压（IS）：5500 V, 源温度（TEM）：500 ℃, 气帘气（CUR）：30 psi, 喷雾气（GSI）：50psi, 辅助气（GS2）：50 psi, 碰撞气（CAD）：High。根据以上条件进行质谱参数优化, 得到东莨菪碱与阿托品的参数见表2。

表2 东莨菪碱和阿托品的检测参数 Table 2 Mass spectrum parameters of scopolamine and atropine
2 结果与讨论
2.1 色谱条件的优化

本文分别考察了0.1 ％甲酸（A）和乙腈（B）、0.1 ％甲酸（A）和0.1 ％甲酸乙腈（B）、0.1 ％甲酸（A）和甲醇（B）作为流动相对检测结果的影响。通过比较峰型、出峰时间、分离效果及灵敏度, 实验结果表明：选用0.1％甲酸（A）和乙腈（B）作为流动相进行梯度洗脱的效果最好。本文比较了流速为0.3、0.4、0.5 mL/min的检测结果, 实验结果显示：流速为0.4 mL/min时对目标物分离效果较好, 有更好的峰型, 出峰时间合适, 如图3。

图3 空白血中东莨菪碱（上）和阿托品（下）的色谱图Fig.3 Chromatograms of scopolamine (above) and atropine (below) in blank blood

2.2 质谱条件的选择

分别配制100 ng/mL东莨菪碱和阿托品的标准品溶液, 选择ESI+电离模式, 使用直接进样法, 优化质谱条件。通过一级全扫描质谱得到东莨菪碱和阿托品的母离子质量数 [M+H]+分别为m/z 304.1、m/z 290.1。在确定母离子的基础上, 对母离子进行二级质谱分析, 调节碰撞能量CE进行优化选择, 并优化去簇电压（DP）, 最后选择强度最高的2对母离子/子离子对作为定性离子对, 其中最强的一对离子作为定量离子对。最终优化后的参数见表2。在上述条件下检测东莨菪碱和阿托品, 结果显示：东莨菪碱的保留时间在1.47 min, 阿托品的保留时间在1.55 min, 均有良好的色谱峰。

2.3 方法学考察

2.3.1 前处理方法

本文考察了乙腈和甲醇两种沉淀剂, 实验结果显示对于东莨菪碱和阿托品, 沉淀剂使用乙腈的回收率较高于甲醇, 且乙腈形成的沉淀为块状, 较为稳定。因此, 本实验选用乙腈作为沉淀剂。

2.3.2 工作曲线和检出限

取空白全血和东莨菪碱与阿托品混合标准品溶液, 5份血液样品各0.5mL, 分别配制成1、5、10、50、100 ng/mL系列浓度的对照样品溶液。按1.2方法进行前处理, 在选定的色谱和质谱条件下进行仪器分析。分别以东莨菪碱、阿托品峰面积对溶液浓度进行线性回归, 实验结果显示：东莨菪碱和阿托品在1~100 ng/mL范围内线性关系良好, 以信噪比S/N≥ 3作为检出限（LOD）, 以信噪比S/N≥ 10作为最低定量限（LOQ）, 结果详见表3。

2.3.3 回收率和精密度

取空白全血0.5 mL, 分别添加浓度为10、50、100 ng/mL的东莨菪碱和阿托品的标准品溶液, 每个浓度有三组平行样, 均按照1.2中的方法进行前处理, 在选定的色谱和质谱条件下进行仪器分析。测得回收率见表4。按上述方法配制三种浓度标准品, 每个样本浓度平行做三组, 按1.2方法进行处理, 在一日内三个不同时间进行仪器检测, 计算各样本峰面积的相对标准偏差, 得到日内精密度。按同样方法配制三种浓度, 按1.2方法进行前处理和仪器检测, 在连续三日同一时间重复此实验, 计算各样本峰面积的相对标准偏差, 得到日间精密度。实验结果见表4。

表3 东莨菪碱和阿托品的回归方程、线性区间和检出限 Table 3 Regression equations, linear range and limits of detection for both scopolamine and atropine
表4 东莨菪碱和阿托品的回收率和精密度 Table 4 Recoveries and precisions of scopolamine and atropine
3 结论

本文建立了一种超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）检测全血中的东莨菪碱和阿托品的检测方法, 该方法简单, 快捷, 灵敏度高, 能满足实际办案中的定性与定量检测要求。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
[1] 张宏利, 杨学军, 刘文国, 等. 曼陀罗化学成分与生物活性研究现状及展望[J]. 西北林学院学报, 2004, 19(2): 98-102. [本文引用:1]
[2] 徐宁, 冉俊祥, 杨占臣, 等. 曼陀罗毒性的研究进展[J] . 检验检疫学刊. 2009(1): 62-65. [本文引用:1]
[3] 李岩, 孟庆勇, 赵欣, 等. HPLC法测定天仙子东莨菪碱和莨菪碱的含量[J] 新疆医科大学学报, 2015, 38(1): 64-66. [本文引用:1]
[4] 陈妤, 闫晓楠, 杨晓宏. HPL法同时测定华山参中山莨菪碱、东莨菪碱、阿托品的含量[J]. 药学研究, 2015, 34(4): 209-211. [本文引用:1]
[5] 周军, 赵晨, 张洋, 等. HPLC法测定华山参滴丸中东莨菪碱、阿托品及东莨菪内酯的含量[J]. 药物分析杂志, 2012, 32(5): 892-895. [本文引用:1]
[6] 祁文娟, 王兆基, 吴志成. 毒性中药天仙子有效成分的液相色谱一质谱法定性定量分析[J]. 药物分析杂志, 2012, 32(4): 599-602. [本文引用:1]
[7] 夏天, 石力夫, 胡晋红. LC/MS/MS法测定氢溴酸东莨菪碱在大鼠体内的组织分布[J]. 药物分析杂志, 2012, 32(1): 26-29. [本文引用:1]
[8] ZHANG PT, LI YM, LIU GH, et al. Simultaneous determination of atropine, scopolamine, and anisodamine from Hyoscyamus niger L. in rat plasma by high-performance liquid chromatography with tand em mass spectrometry and its application to a pharmacokinetics study[J]. Liquid Chromatography. 2014. 37: 2664-2674. [本文引用:1]
[9] KOZELJ G, PERHARIC L, STANOVNIK L, et al. Simple validated LC-MS/MS method for the determination of atropineand scopolamine in plasma for clinical and forensic toxicologicalpurposes[J]. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 2014. 96: 197-206. [本文引用:1]
[10] CHEN HP, MARIN-SAEZ J, ROMERO-GONZALEZ R, et al. Simultaneous determination of atropine and scopolamine in buckwheat and related products using modified QuEChERS and liquid chromatography tand em massspectrometry[J]. Food Chemistry. 2017. 218: 173-180. [本文引用:1]
[11] 李伟, 李洪霞, 柴金岭, 等. 区带毛细管电泳法分离测定洋金花中莨菪烷类生物碱[J]. 分析试验室, 2006, 25(5): 56-58. [本文引用:1]
[12] 李霞, 罗晶, 柳小秦, 等. 区带毛细管电泳法分离测定莨菪浸膏片中莨菪烷类生物碱[J]. 药物分析杂志, 2008, 28(1): 121-123. [本文引用:1]
[13] 秦国富, 李恒新, 李永波, 等. 液液萃取/气相色谱/质谱联用法同时测定曼陀罗中的消旋山莨菪碱、东莨菪碱与莨菪碱[J]. 中国食品卫生杂志, 2014, 26(4): 351-354. [本文引用:1]