引用本文
李进, 李继印, 张福军, 周艳娟, 刘洪敏, 李虹, 谢彦明, 黄垒. 超高效液相色谱-串联质谱法测定唾液中氯胺酮[J].刑事技术, 2017,42(1):48-51
LI Jin, LI Jiyin, ZHANG Fujun, ZHOU Yanjuan, LIU Hongmin, LI Hong, XIE Yanming, HUANG Lei. Determination of Ketamine in Saliva by Ultra High Performance Liquid Chromatography-tandem Mass Spectrometry[J]. Forensic Science and Technology,2017,42(1): 48-51  
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超高效液相色谱-串联质谱法测定唾液中氯胺酮
李进1, 李继印2, 张福军3, 周艳娟4, 刘洪敏2, 李虹5,*, 谢彦明1, 黄垒1
1. 普洱市公安局,云南 普洱 665000
2. 昆明医科大学法医学院,昆明650500
3. 昆明市公安局五华分局,昆明 650032
4. 德宏州公安局,云南 德宏 678400
5. 云南省公安厅毒品分析及禁毒技术公安部重点实验室,昆明 650228
* 通讯作者：李虹（1963—）,女,云南个旧人,学士,主任法医师,研究方向为毒物毒品分析。E-mail:yngalh@163.com

第一作者简介：李进（1976—）,男,云南普洱人,本科,工程师,研究方向为毒物毒品及微量物证检验。E-mail:331370737@qq.com

基金资助: 公安部科技强警基础工作专项项目（NO.2013GABJC015）
摘要

目的 建立唾液中氯胺酮的超高效液相色谱-串联质谱检测方法。方法 采用甲醇沉淀蛋白法进行样本前处理,使用有机滤膜净化后,用两对特征离子定性及外标标准曲线法定量检测氯胺酮。结果 氯胺酮的线性范围为1~100 ng/mL（ r=0.9990）,检出限、定量限分别为0.06、0.21 ng/mL;提取回收率均高于90 %,日内及日间精密度均小于10 %。结论 本文建立的超高效液相色谱-串联质谱法操作简便快速,提取回收率高,灵敏度高,重现性好,可用于吸毒检测工作中氯胺酮的检测。

关键词: 法医毒物分析; 氯胺酮; 唾液; UPLC-MS/MS
中图分类号:DF795.1 文献标志码:A 文章编号:1008-3650(2017)0048-04 doi: 10.16467/j.1008-3650.2017.01.011
Determination of Ketamine in Saliva by Ultra High Performance Liquid Chromatography-tandem Mass Spectrometry
LI Jin1, LI Jiyin2, ZHANG Fujun3, ZHOU Yanjuan4, LIU Hongmin2, LI Hong5, XIE Yanming1, HUANG Lei1
1. Puer Municipal Public Security Bureau, Yunnan, Puer 665000, China
2. Institute of Forensic Medicine, Kunming Medical University, Kunming 650500, China
3. Wuhua Branch of Kunming Municipal Public Security Bureau, Kunming 650032, China
4. Dehong Prefectural Public Security Bureau, Yunnan, Dehong 678400, China
5. Key Laboratory of Narcotics Assay and Control Technology, Ministry of Public Security, affiliated under Yunnan Public Security Bureau, Kunming 650228, China
Abstract

ObjectiveUltra high performance liquid chromatography - tandem mass spectrometry was developed for determination of ketamine in human saliva.Methods Samples were prepared by protein precipitation with methanol and purified with organic filter membrane. Two characteristic ion pairs were chosen for qualitative analysis and external standard choice was used for quantitative analysis of ketamine.Results The linear range was 1~100 ng/mL for ketamine (r=0.9990). The limits of detection and quantification were respectively 0.06 ng/mL and 0.21 ng/mL in saliva. The extraction recoveries of ketamine were above 90%, intra-day and inter-day precisions were all less than 10%.Conclusions This method is simple, rapid, high recovery, high sensitivity and good reproducibility, able to be used for ketamine analysis in drug testing.

Key words: forensic toxicological analysis; ketamine; saliva; UPLC-MS/MS

氯胺酮（ketamine）俗称“ K粉” , 镇痛药类, 由美国药剂师Stevens于1962年首次成功合成, 后被用于战争创伤外科手术麻醉药及临床手术麻醉剂或麻醉诱导剂; 因其具有致幻作用, 在世界范围内被广为滥用。在我国, 氯胺酮的滥用日趋严重, 尤其在一些歌舞厅等娱乐场所较多见, 使用群体以青少年为主, 滥用方式主要经鼻、口吸食, 通常与海洛因、大麻等毒品合并使用。用鼻吸食氯胺酮吸收、起效快, 一般在5~10 min内起效, 在鼻、口腔黏膜及大脑等高灌注组织中氯胺酮含量较高[1], 人体内氯胺酮代谢半衰期为2~4 h。目前, 国内外对人体血液、尿液和头发中新型毒品氯胺酮的检测方法有一定研究, 通常采用GC/MS法[2, 3, 4, 5, 6]、LC-MS/MS法[7, 8, 9, 10, 11, 12, 13], 其中以LC-MS/MS法检测为主, 而对唾液中氯胺酮的检测方法文献报道仍然较少。本文采用超高效液相色谱-串联质谱法对唾液中氯胺酮的定性定量检测方法进行了研究。

1 材料与方法
1.1 仪器与试剂

超高效液相色谱-串联质谱仪, 配Agilent 1290型超高效液相色谱仪（Analyst® software 工作站）和AB SCIEX 4000Q TRAP 串联质谱仪, 电喷雾离子源（ESI）。

氯胺酮购自公安部物证鉴定中心; 化学试剂乙腈、甲醇为色谱纯, 甲酸、氨水为分析纯, 实验用水为屈臣氏去离子水。

1.2 实验样品

35份唾液样品均采自云南氯胺酮滥用者。

1.3 方法

1.3.1 分析条件

色谱条件：安捷伦C18色谱柱(2.1 mm× 50 mm, 1.8 μ m ); 流动相A为乙腈, 流动相B为0.1 %氨水溶液; 洗脱梯度：0~1 min流动相A为1 %; 1~2 min流动相A由1 %升到90 %; 2~2.5 min流动相A为90 %; 2.5~3.5 min流动相A由90 %降到1 %, 3.5~6 min流动相A为1 %。进样体积5 μ L; 流速0.4 mL/min; 运行时间6.01 min; 柱温35 ℃。

质谱条件：电喷雾离子源（Turbo Spray）采用正离子扫描, 多反应监测（MRM）, 三重四极杆检测器; 毛细管电压为5.5 kV; 离子源温度为300 ℃。氯胺酮的监测离子及锥孔电压、碰撞电压等参数如表1所示。

表1 氯胺酮的监测离子、锥孔电压及碰撞能 Table 1 Monitor ion, cone voltage and collision energy of ketamine

1.3.2 样品处理

取唾液加适量甲醇并稀释至一定倍数, 经振荡3 min、超声10 min、离心5 min, 取上清液过有机滤膜(13mm× 0.22μ m)后供检。

1.3.3 标准品工作溶液的配制

使用1.0 mg/mL氯胺酮标准品经稀释得到100.0、50.0、25.0、10.0、5.0、1.0 ng/mL的标准工作液, 置4 ℃冰箱保存。

2 结果与讨论
2.1 系统适应性试验

在前述检测条件下, 分别对空白唾液、空白唾液添加和氯胺酮滥用者唾液样品进样分析, 以238.20/207.10和238.20/125.00 两个离子对、保留时间（tR=2.01 min）和已知氯胺酮标准物质比对进行定性, 阴性对照无干扰; 结果表明UPLC -MS/MS检测方法专属性好。氯胺酮的色谱图如图1所示。

图1 唾液中氯胺酮的MRM色谱图（a.空白唾液; b.基质加标溶液(5ng/mL); c.氯胺酮滥用者唾液样品）Fig.1 MRM chromatogram of ketamine in saliva (a. saliva blank; b. spike matrix solution(5ng/mL); c. saliva sample of ketamine abuser)

2.2 流动相的选择

本文分别用0.1 %甲酸的乙腈-0.1 %氨水溶液（A）、乙腈-0.1 %氨水溶液(B)、乙腈-0.1 %甲酸溶液(C)和乙腈-0.3 %甲酸溶液(D)四种流动相对空白添加溶液（25 ng/mL）进行梯度洗脱, 经UPLC-MS/MS法进样分析。结果表明：氯胺酮在碱性流动相乙腈-0.1 %氨水溶液中响应度最高。因此, 本文选用乙腈-0.1 %氨水溶液作为流动相。

图2 氯胺酮在不同流动相中的响应度Fig.2 The responses of ketamine in different kinds of mobile phase

2.3 线性范围、检出限和定量限

将氯胺酮标准品工作液添加至空白唾液中, 按1.3.2方法处理成浓度分别为1.0、5.0、20.0、25.0、50.0、100.0 ng/mL系列浓度的空白添加溶液, 按1.3.1条件检测; 采用MultiQuant 2.1软件中Quqntitate组件, 以定量离子（238.20/125.00）峰面积A为纵坐标, 质量浓度C为横坐标作图, 求得标准曲线的线性回归方程为A=24000C+3320, r=0.9990, 氯胺酮在1~100 ng/mL范围内线性关系良好。检出限（LOD）为0.06 ng/mL（以信噪比S/N大于3为评价标准）, 定量限（LOQ）为0.21 ng/mL（以信噪比大于10为标准）。

2.4 回收率、基质效应、准确度和精密度

将氯胺酮标准品工作液添加至空白唾液中, 按1.3.2方法处理成浓度分别为5.0、50.0、90.0 ng/mL的空白添加溶液, 平行操作6份, 在1.3.1条件下对以上三种工作溶液进样分析（n=6）。计算回收率和基质效应。一日内连续测定6次, 每次间隔2 h, 计算日内精密度; 连续测定6天, 每天测定一次, 计算日间精密度。如表3示：唾液样品中氯胺酮的提取回收率、基质效应、准确度和日内、日间精密度分别在90 %~105 %、96 %~115 %、 97 %~103 %和 0~7 % 范围内。结果表明, 该检测方法具有良好的准确度、精密度、提取回收率和较低的基质效应（见表2）。

表2 氯胺酮的回收率、基质效应、准确度和精密度测定结果 Table 2 Results of recovery, matrix effect, accuracy and precision of ketamine
2.5 稳定性

将氯胺酮标准品工作液添加至空白唾液中, 配制成一定浓度的低、中、高3种基质加标溶液, 室温放置24 h及经过3次冻融循环后, 按1.3.2方法处理基质加标唾液成浓度分别为5.0、50.0、90.0 ng/mL的基质加标溶液（n=6）, 并在1.3.1的实验条件下测定, 考察其短期稳定性及解冻稳定性。结果表明, 氯胺酮在上述条件下均稳定（见表3）。

表3 氯胺酮的稳定性测定结果 Table 3 Stability results of ketamine（n=6）
2.6 实际唾液检测

用UPLC-MS/MS法分别对35份氯胺酮滥用者的真实唾液样品进行检验分析, 检出氯胺酮含量低于1 μ g/mL样品6例, 含量在1 μ g/mL至100 μ g/mL之间的样品1例, 含量高于100 μ g/mL的样品24例; 未检出氯胺酮的样品4例; 检出率88.6 %。结果表明：氯胺酮滥用者的唾液中, 氯胺酮的检出率高, 且含量比较高。分析者认为, 唾液中氯胺酮含量的差异可能与氯胺酮的摄入方式、摄入量及唾液采集时间有关, 尤其是吸食氯胺酮时, 其唾液中氯胺酮的含量往往较高, 因为唾液中的淀粉酶不能水解氯胺酮, 因此能检测出氯胺酮原体。

3 结论

本文选用甲醇蛋白沉淀法处理唾液样品中的氯胺酮, 具有提取回收率高、基质效应好、处理操作简便等优点, 适用于唾液样品中氯胺酮的提取、分离。分别考察了碱性流动相、酸性流动相等多种流动相对氯胺酮色谱质谱行为的影响, 结果表明氯胺酮在碱性流动相中色谱行为好、响应度高, 故选用碱性流动相对氯胺酮进行梯度洗脱。本文建立的超高效液相色谱-串联质谱法操作简便、快速、灵敏度高, 可作为吸毒检测工作中对氯胺酮检测的一种新方法。

The authors have declared that no competing interests exist.

作者已声明无竞争性利益关系。

参考文献
[1] 刘小兴, 熊勇华. 氯胺酮检测研究进展[J]. 中国公共卫生, 2007, 23(5): 629-631. [本文引用:1]
[2] 邸玉敏, 朱军, 常靖, 等. GC/MS、GC/NPD法检测血液中氯胺酮[J]. 中国法医学杂志, 2010, 25(3): 169-171. [本文引用:1]
[3] 常崇佐. 气相色谱-质谱联用检测唾液中氯胺酮[J]. 分析仪器, 2010(6): 26-29. [本文引用:1]
[4] 朱军, 邸玉敏, 常靖, 等. GC/MS、GC/NPD法检测毛发中的氯胺酮[J]. 中国法医学杂志, 2013, 28(3): 184-187. [本文引用:1]
[5] SO P K, NG T T, Wang H X, et al. Rapid detection and quantitation of ketamine and norketamine in urine and oral fluid by wooden-tip electrospray ionization mass spectrometry[J]. The Analyst: The Analytical Journal of the Royal Society of Chemistry, 2013, 138(8): 2239-2243. [本文引用:1]
[6] LIAN K, ZHANG P, NIU L, et al. A novel derivatization approach for determination of ketamine in urine and plasma by gas chromatography-mass spectrometry[J]. Journal of chromatography, A, 2012, 1264(22): 104-109. [本文引用:1]
[7] 高秀蓉, 刘莉. UPLC-TOF/MS法检测减肥中药制剂中的盐酸氯胺酮[J]. 华西药学杂志, 2012, 27(4): 467-468. [本文引用:1]
[8] 翟晚枫, 张春水, 高利生, 等. 液相色谱-质谱联用同时检测17种常见毒品的定性分析方法[J]. 刑事技术, 2014, (3): 24-25, 32. [本文引用:1]
[9] HARUN N, ANDERSON R A, CORMACK P A, et al. Analysis of ketamine and norketamine in hair samples using molecularly imprinted solid-phase extraction (MISPE) and liquid chromatography-tand em mass spectrometry (LC-MS/MS)[J]. Analytical and bioanalytical chemistry, 2010, 396(7): 2449-2459. [本文引用:1]
[10] ZHU K Y, LEUNG K W, TING A K, et al. The establishment of a highly sensitive method in detecting ketamine and norketamine simultaneously in human hairs by HPLC-Chip-MS/MS[J]. Forensic science international, 2011, 208(1-3): 53-58. [本文引用:1]
[11] NETTO J D, MAKER G C, MAKER G L, et al. Liquid chromatography tand em mass spectrometry for the simultaneous quantitative analysis of ketamine and medetomidine in ovine plasma[J]. Biomedical Chromatography, 2011, 25(12): 1374-1380. [本文引用:1]
[12] NEMA T, CHAN E C, HO P C, et al. Extraction of ketamine from urine using a miniature silica monolithic cartridge followed by quantification with liquid chromatography tand em mass spectrometry (LC-MS/MS)[J]. Journal of separation science, 2011, 34(9): 1041-1046. [本文引用:1]
[13] TSUI T K, CHAN A S, LO C W, et al. Performance of a point-of-care device for oral fluid ketamine evaluated by a liquid chromatography-tand em mass spectrometry method[J]. Journal of Analytical Toxicology, 2012, 36(3): 210-216. [本文引用:1]