引用本文
俞卫东, 连昌舟, 孙大鹏. 激光捕获显微切割技术在强奸案中的检验研究[J].刑事技术, 2017,42(1):25-27
YU Weidong, LIAN Changzhou, SUN Dapeng. Applying Laser Capture Microdissection to Separate the Shape-different Cells for Testing the Mixed Samples in Rape Cases[J]. Forensic Science and Technology,2017,42(1): 25-27  
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激光捕获显微切割技术在强奸案中的检验研究
俞卫东, 连昌舟, 孙大鹏
南京市公安局刑事侦查局,南京210012

第一作者简介：俞卫东（1969—）,男,江苏南通人,学士,主任法医师,研究方向为法医遗传学。E-mail:13505192778@163.com

基金资助: 南京市公安局科研项目（No. KY2014009）
摘要

目的 研究建立一套以激光捕获显微切割技术（LCM）分离强奸案混合样本的检验方法。方法 通过不同的样本制备、染色并比较DNA分型结果,确立了以去离子水处理样本,苏木素或甲基紫染色制备样本并经细胞涂片、切割收集进行DNA检测与分型的方法。结果 建立的方法能从15个上皮细胞、50个精子细胞中稳定检出正确且完整的STR分型。结论 本实验方法可用于强奸案中混合斑的检验。

关键词: 法医物证; 激光捕获显微切割技术; 混合样本; STR分型
中图分类号:DF795.2 文献标志码:A 文章编号:1008-3650(2017)01-0025-03 doi: 10.16467/j.1008-3650.2017.01.005
Applying Laser Capture Microdissection to Separate the Shape-different Cells for Testing the Mixed Samples in Rape Cases
YU Weidong, LIAN Changzhou, SUN Dapeng
Institute of Forensic Science, Nanjing Public Security Bureau, Nanjing 210012, China
Abstract

ObjectiveTo establish a method of separating different cells in mixtures from rape cases with laser capture microdissection (LCM) technique.Methods Sample preparation was tried with different methods, and so was the cell-staining choices. Therefore, through the sample to be treated with pure water plus hematoxylin or methyl violet to stain the cells that were subjected to painting and dissecting for collection by LCM, DNA has been harvested to result in its tested genotypes showing correct.Results The full and correct STR profiles can be stably obtained from no less than 15 somatic or 50 sperm cells.Conclusion The method established in this paper can be used for testing the mixtures of rape cases.

Key words: forensic material evidence; laser capture microdissection (LCM); mixture sample; STR typing

在强奸案件的检验中, 经常会出现男女物质混合的检材, 采用传统的差异裂解法常难以将女性成分去除干净, 致使得到的混合分型难以判定[1, 2], 影响结果的应用和证据的强度。激光捕获显微切割技术（Laser Capture Microdissection, LCM）可实现对上皮细胞、精子细胞等不同形态细胞的分离检验 [3], 从而获得单一的DNA分型, 有利于结果的应用和解释。

本文针对强奸案中的混合检材, 利用激光捕获显微切割技术, 研究建立一套适用于强奸案中混合检材的DNA分离检验方法。

1 材料和方法
1.1 仪器和试剂

PALM MICROBEAM激光捕获显微切割系统（ZEISS公司）; 覆膜玻片（MembraneSlide 1.0 pet, ZEISS公司）; 台式高速离心机（Eppendorf公司）; 9700扩增仪（Life Technologies公司）; 3500XL分析仪（Life Technologies公司）; GlobalFilerTM PCR Amplification Kit（Life Technologies公司）。

15 mg/mL蛋白酶K（Roche公司）; 1 mol/L DTT（Promega公司）; 2 % Chelex（Sigma公司）; 10 mg/mL牛血清白蛋白（BSA）（Promega公司）; 5 %甲基紫染液或5 %苏木素染液。收集消化液（组分100 μ L 2 % Chelex、1 μ L 15 mg/mL PK, 收集精子需加入4 μ L 1 mol/L DTT）。

1.2 样本

强奸案检材（床单布片、内裤）上的斑迹。

1.3 方法

1.3.1 样品处理

剪取适量检材于1.5 mL离心管中, 加入适量去离子水, 浸泡振荡15 min, 套管高速离心3 min, 弃检材、上清, 沉淀中加入去离子水振荡洗涤1~2次, 13 000 r/min离心3 min, 弃上清, 沉淀中加入100 μ L去离子水, 混悬备用。

1.3.2 染色

悬液中加入1 μ L 5 %甲基紫溶液或2 μ L 5 %苏木素溶液, 混匀, 室温静置染色5~10 min（苏木素染色延长10 min）。13 000 r/min离心3 min, 小心吸弃上清, 留约15 μ L左右液体, 加入1~2 μ L 10 mg/mL BSA溶液, 混匀。

1.3.3 涂片

在覆膜玻片无膜面用记号笔标出界线, 吸取1-2 μ L染色后的细胞悬液在膜面上用吸头侧壁均匀涂片, 室温晾干或56℃以下烘干。

1.3.4 切割收集细胞

将细胞涂片置于激光捕获显微切割系统的倒置显微镜上, 膜面朝上。20倍镜下选定目标细胞（上皮细胞核选定15个、精子选定50个）。吸取12 μ L收集消化液于200 μ L平头扩增管盖中, 均匀涂满管盖, 以承接弹射的细胞, 将扩增管盖倒置于收集位置后, 对已选定的细胞进行切割弹射收集。

1.3.5 模板DNA的提取

将收集有目标细胞的200 μ L扩增管小心取下, 高速瞬时离心20 s, 置加热仪上56 ℃、45 min, 99 ℃、10 min 进行消化提取DNA, 13 000 r/min离心2 min, 上清备用。

1.3.6 PCR扩增

用GlobalFilerTM试剂盒扩增。反应体系5 μ L (Master Mix 1.5 μ L, Primer Set 0.5 μ L, DNA模板3 μ L）, 扩增条件：95 ℃、1 min, 94 ℃、10 sec, 59 ℃、90 sec, 32个循环; 60 ℃、10 min, 4 ℃保持。每份样品平行扩增3次。

1.3.7 扩增产物的检测与数据分析

吸取全部扩增产物于15 μ L上样液中, 变性后, 用3500xL分析仪检测, 进样条件1.2 kV、15 s。数据分析时, 根据峰的高度、平行检验中出峰的次数、峰的均衡性、是否有杂峰等情况, 综合3次平行结果进行判定。

2 结果和讨论

本研究利用激光捕获显微切割系统和实验室常规设备建立了一套强奸案中混合检材DNA分离检验的方法。对两起强奸案中的床单和内裤上的斑迹分别进行检验, 样本制备后, 每种检材分别切割出3份15个上皮细胞核、5份50个精子细胞, 以Chelex法提取DNA、GlobalFilerTM试剂盒扩增以及3500xL分析仪检测, 获得的STR分型均正确完整, 效果较理想。由于切割收集的细胞数较少、扩增时采用32个循环, 部分基因座等位基因存在不平衡、缺带和非特异性条带等现象, 综合分析每份样品三次平行检验的结果, 可显著提高样品分型的准确度。

按容差2个基因座统计（24个基因座中允许2 个基因座有误差）, 15个上皮细胞核每个平行管22个以上基因座分型正确率为89 %（见表1：样本1~3为强奸案1床单上切割的3份15个上皮细胞; 样本4~6为强奸案2内裤上切割的3份15个上皮细胞。容差2个基因座：每个平行管22个以上基因座完全正确为16/18, 占89%, 综合分析STR分型正确率达100%。）、50个精子每个平行管22个以上基因座分型正确率为90 %（见表2：精子1~5为强奸案1床单上切割的5份50个精子; 精子6~10为强奸案2内裤上切割的5份50个精子。容差2个基因座：每个平行管22个以上基因座完全正确为26/30, 占87%, 综合分析STR分型正确率达100%）, 所检测共16份样品均获得了22个以上基因座的正确分型。

表1 6份15个体细胞分型结果 Table 1 STR typing results of every 15 somatic cells from each of 6 samples
表2 10份50个精子细胞分型结果 Table 2 STR typing results of every 50 sperm cells from each of 10 samples

利用激光捕获显微切割系统检验时, 细胞染色十分重要。本文利用口拭细胞悬液, 以水、TNE、Tris-HCl作为检材处理液, 分别用甲紫染液、苏木素染液、美兰染液、甲苯胺兰染液进行染色, 镜下观察染出的细胞数和核清晰度, 发现以水处理检材, 染色效果比较理想; 在染出的细胞数上, 以甲紫的效果最好; 在核清晰度方面, 苏木素染色的效果更好; 而美兰和甲苯胺兰染色效果稍差, 而且染色时间较长。对于精子染色, 甲紫和苏木素染色的效果均较好。综合考虑染色时间、效果和检验结果, 确立了以水为基质液, 甲紫或苏木素染色的方法。染液配置时, 不应加入增强染色效果的乙酸等酸性试剂, 否则会明显影响DNA检验效果。细胞涂片时, 有时由于细胞悬液表面张力大, 不易均匀涂片, 在染色后的细胞悬液中加入BSA, 能起到降低表面张力、增加附着力的作用, 使细胞悬液能均匀涂抹于目标区域, 便于细胞的定位寻找。收集细胞时, 12 μ L消化收集液正好可铺满200 μ L的平头扩增管盖, 从而能承接上弹的细胞。离心后直接消化提取DNA, 最大程度地减少了DNA损失和潜在污染, 且体积能够进行三次平行扩增。与用扩增试剂承接收集直接扩增相比, 消化提取DNA方法释放DNA更加彻底, 可以进行平行扩增而利于综合判定, 能有效提高检验成功率和分型正确性 [4]。

激光显微切割捕获系统的最大优势在于分离细胞, 获得单一的分型结果; 其难点主要在于目标细胞的寻找和定位, 特别是寻找精子细胞。因此, 如何利用较少的细胞获得可靠的检验结果是本文研究的重点。分析时, 也发现精子检验出现杂带的几率要高于上皮细胞, 这可能与精子检验时切割次数较多, 容易引入污染有关, 因此, 实验室应保持设备环境的洁净, 操作中避免污染。

综上, 本研究建立的方法, 能从15个体细胞或50个精子细胞中较为稳定地获得正确且完整的STR分型, 为从强奸案混合斑中检出单一的DNA图谱提供了新的方法和手段。

The authors have declared that no competing interests exist.

作者已声明无竞争性利益关系。

参考文献
[1] Li CX, Han JP, Ren WY, et al. DNA profiling of spermatozoa by laser capture microdissection and low volume-PCR[J]. PloS One, 2011, 6(8): 22316. [本文引用:1]
[2] 吴微微, 苏艳佳, 郝宏蕾, 等. 激光捕获显微分离技术在DNA检验中的应用研究[J]. 刑事技术, 2011(6): 10-12. [本文引用:1]
[3] 丰蕾, 杨帆, 李彩霞, 等. 单细胞分离检验技术在法医学中的应用研究[J]. 刑事技术, 2015(5): 359-363. [本文引用:1]
[4] Budowle B, Eisenberg AJ, van Daal A. Validity of low copy number typing and applications to forensic science[J]. Croat Med J, 2009, 50(3): 207-217. [本文引用:1]