参照中华人民共和国卫生部发布的国家标准GB4793.1-2007^[4], 设计了下列的功能模块：垂直机械取样模块、机械臂固定水平移动模块、样本收集模块、照明及消毒模块、电气控制模块, 使骨骼取样过程电动机械化, 并委托广州市花都新华轻工机械厂制作模型及样机。该设备设计图见图1（1.总开关; 2.夹具水平移动按钮; 3.钻头速度调节旋钮; 4.钻头开关; 5.钻头垂直运动按钮; 6.紫外灯开关; 7.LED照明开关; 8.箱体; 9.钻头; 10.导轨; 11.紫外灯; 12.不锈钢漏斗; 13.不锈钢试管架; 14.传动丝杆）。设备操作空间合理, 机械结构布局便于操作, 紫外消毒不留死角, 模块操作顺畅, 样本收集漏斗与收集试管连接紧密, 收集过程连续流畅。

图1

Fig.1

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	图1 骨骼取样设备整体设计图Fig.1 The integral design chart of the bone sampling instrument

选择直径d=3 mm铣钻作为骨骼取样钻头, 可根据骨骼状态调整钻速, 推荐钻速设置为1 800 r/min, 获取0.5 g骨粉耗时8~10 min。钻头在马达驱动的丝杆下可在垂直方向上下移动, 钻头在钻取的过程中, 可自动缓慢向下钻动, 钻头与电机之间以连杆固定连接。松开连杆, 钻头可拆卸、清洗和高温消毒。采用V字缺口机械臂夹具, （图2：1.骨骼固定杆; 2.控制连接丝杆卡接机构的弹簧; 3.卡接机构的下臂; 4.卡接机构; 5.卡接机构的上臂; 6.卡住传动机构的固定凸起; 7.导轨连接的连接座; 8.导轨凸起杆穿过连接座上的通孔; 9.支架; 10.支架下臂; 11.下臂上卡住骨股样品的卡接部; 12.支架上臂）固定骨骼, 夹具固定栓的自由行程范围为0~600 mm, 夹具通过卡扣与水平方向运动的导轨相连接, 在导轨上由电机驱动的丝杆带动做水平移动。夹具易于拆卸清洗, 并能高温消毒。

样本收集装置包括可拆卸清洗和耐高温的大倾角不锈钢漏斗、可转换档位选择不同收集位置的不锈钢试管架（图3：1.连续收集样本的档位转换主体; 2.转换收集样本试管的档位拨杆; 3.用于收集骨骼粉末样本的试管; 4.用于收集骨骼粉末样本的试管的插孔; 5.用于保障收集管与收集漏斗连接紧密的弹簧; 6.试管下部的固定顶板; 7.调节弹簧按钮）适配2 mL Eppendorf离心管进行取样。

样机内部消毒选用4支254 nm的紫外灯（每支功率8 W）, 嵌于取样腔的上部与下部, 上下各2支, 腔内紫外线强度最小约为160 μ W/cm², 超过国家标准（70 μ W/cm²）的要求, 使外源游离DNA形成嘧啶二聚体, 达到防污染的目的。由于紫外灯管贴近内腔平面, 其紫外线发射角度可达170 ° , 加上紫外光源上下交错, 可以消除取样腔内的照射死角。照明光源：取样腔内选用5 W的LED灯带（左右各一）, 收集腔内选用5 W的LED灯带。采用可透紫外线的石英玻璃封盖紫外灯, 普通玻璃封盖LED。使用简约的电子按钮作为控制元件, 简便实用。样机箱体（机体、夹具、收集漏斗、收集试管架）全部构件采用不锈钢材料制造, 无油漆喷涂。设备长700 mm, 宽400 mm, 高550 mm, 重量为30 kg。

图2

Fig.2

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	图2 V字缺口机械臂夹具Fig.2 The mechanical arm with a V-shaped nick for fastening the bone

图3

Fig.3

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	图3 连续收集样本的档位转换机构Fig.3 The shift-converting setup for continuous collecting samples

广州地区日常检案收集的20根陈旧股骨, 供测试样本研究使用。

1.3.1 骨骼样本预处理

用手术刀刮净股骨样本表面, 清洗, 晾干后用5 %的次溴酸钠溶液浸泡15 min, 蒸馏水清洗, 用75 %的乙醇溶液浸泡1 h脱脂。骨骼放入设备内干燥, 同时开启紫外灯。

1.3.2 骨粉钻取

将骨骼检材固定于夹具上, 移动导轨, 选取检材的合适部位, 操作钻头, 钻取骨骼, 控制收集档位, 收集骨密质粉末样品。

同一骨骼检材以同型号钻头手工钻取, 以滤纸片收集钻取的骨骼粉末, 再转移至离心管中。

1.3.3 DNA提取

收集的骨密质粉末每管约0.5 g, 称重, 加0.5 mol/L EDTA 脱钙液, 37 ℃脱钙12 h(中间更换1次脱钙液)。离心弃脱钙液, 加入骨骼裂解液（Promega公司）、20 μ L 1mol /L DTT溶液、20 μ L 20 mg/mL 蛋白酶K溶液, 56 ℃消化12 h; 再按前量补加蛋白酶K、DTT, 消化6 h以上, 期间振荡3~5 次。消化液以离心半径5 cm、10 000 r/min离心5 min后得到上清液。上清液以Qiaquick PCR Purification kit(Qiagen 公司)进行纯化, 得到DNA^{[5, 6]}。

1.3.4 复合扩增检测及分析

采用Powerplex 21试剂盒( Promega公司)进行性别基因座和20个常染色体STR基因座的复合扩增, 10 μ L 扩增体系, 模板4 μ L, 30次扩增循环。在3130 xL遗传分析仪(AB公司)上进行毛细管电泳分型。所得数据处理用SPSS22.0软件通过χ ²检验进行组间率的比较, P< 0.05为差异具有统计学意义。

样机外观见图4。试制的样机通过20例骨骼样本测试, 运行平稳, 水平导轨与夹具结合牢固, 移动顺畅, 机械臂锁定骨骼稳固, 骨骼粉末细腻均匀, 样本收集过程能够自由切换收集试管, 骨骼粉末能顺畅地进入试管收集架上的试管中, 紫外线和照明强度适当。V字缺口机械臂夹具, 解决了不同弯曲弧度的人骨骼的固定问题; 通过卡扣与导轨可由电机驱动的丝杆带动做水平移动选择采样部位, 解决了手工移动骨骼选择采样部位的问题; 构件易于卡接、拆卸、清洗, 可高温消毒, 解决了取样后遗留的粉末的污染问题。不锈钢材质漏斗具有足够大的倾角, 确保骨骼粉末能在重力作用下通过漏斗进入试管。试管收集器可转换档位来选择不同收集位置的试管, 实现了无需人工转移骨骼样本, 连续切换和收集多管样本的功能。采用不间断电源和电阻调节驱动马达的功率, 便于控制钻头速度, 进而控制骨骼取样点的温度, 避免高温导致DNA失活。设备使用三重的预防漏电和过载的保护模块, 电源经过48 h以上的老化试验, 完全符合国家工业电器的3C认证标准, 可以确保使用安全。

图4

Fig.4

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	图4 试制样机的全貌图Fig.4 The overall view of the model machine

表1是骨骼(股骨)检材手工钻取与设备钻取的评估结果。从表1中可以看出, 手工钻取与设备钻取样本对检验结果无显著影响（P > 0.05）。由于设备钻取在一个密闭的空间内进行, 受环境影响较小, 20例样本取样均未检测到污染发生。而20例手工取样的样本则因取样空间开放, 3例样本出现了疑为污染的杂峰。对于取样时间, 设备取样过程因马达驱动功率较大, 夹具固定牢固, 操作容易, 样本能够实现自动收集, 所以耗时约为手工取样的一半。检验20例骨骼样本, 采用手工钻取一次检验成功18例, 而采用设备钻取一次检验成功19例。两种取样方法均检验失败的骨骼样本, 外观腐败程度较重, 推测其骨细胞DNA严重降解。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 骨骼(股骨)检材手工钻取与设备钻取的评估（n=20） Table 1 The comparison and evaluation of bone sampling between the manual drilling and instrumental operation 指标 手工钻取 设备钻取 一次检验成功率（%） 90 95 基因座缺失发生率（%） 30 25 污染杂峰出现率（%） 15 0 最大取样量（g） 1.568 1.690 最小取样量（g） 0.391 0.256 检材最长时间（年） 5 5 取样处理时长（min） 45 25

表1 骨骼(股骨)检材手工钻取与设备钻取的评估（n=20） Table 1 The comparison and evaluation of bone sampling between the manual drilling and instrumental operation

在对20例股骨样本进行取样试验时发现, 取出骨粉粉末时, 设备门开关会产生轻微风洞效应, 导致骨骼粉末易飘散于漏斗外, 产生污染隐患。虽然铣钻的铣刀直径小（d=3 mm）, 获得的粉末粒度细, 但其重量轻容易飞散。为了解决这个问题, 改用钻头为直径较大的铣钻（d=8 mm）, 增大切割面积, 形成体积增大的刨花状骨粉样本。经初步试验, 改进后钻头钻取的骨粉, 由于其重量的增大, 不受仪器门开关形成的风洞效应和气流影响, 解决了易飘散问题。法医物证领域检验的骨骼多为人股骨, 因此设计时, V字缺口夹具固定栓的自由行程范围为0~600 mm, 可以满足对人股骨取样需求。然而, 考虑到年幼死者的股骨较细小, 并且检材可能为其他部位骨骼（如肩胛骨、颅盖骨等）, 特设计制作骨骼机械附件夹具(见图5), 其中固定栓的自由行程范围为(0~300 mm), 在一定程度上满足对不同类型骨骼取样的需求。

图5

Fig.5

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	图5 骨骼机械附件夹具Fig.5 The accessory clamp for fastening the bone

对分别来自两个案件的骨骼检材使用该设备进行机械取样及DNA检验。案例1中检材是约5年的陈旧股骨及部分颅骨, 使用骨骼取样设备钻取骨粉后按1.3.3及1.3.4方法检验, 获得16个STR基因座的基因分型(见图6)。由于检材腐败, DNA降解严重, 造成4个STR基因座片段缺失。案例2中检材是约1年的肱骨, 检材保存较好, 经检验, 获得19个STR基因座的基因分型(见图7)。骨骼DNA检验中, 常因检材腐败导致DNA降解或片段缺失。这2个案例的检材状态不同, 但都能通过人骨骼取样设备进行前处理取样, 获得可成功检验的优质样品, 能满足法医DNA检验需求。

图6

Fig.6

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	图6 案例1骨骼样本检验的STR分型图谱Fig.6 The bone of case 1 and its STR profile tested

图 7

Fig.7

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	图 7 案例2骨骼样本检验的STR分型图谱Fig.7 The bone of case 2 and its STR profile tested

综上, 本文所述人骨骼取样设备能机械操控人骨骼(包括长骨、扁骨等适宜夹具固定的骨骼样本)钻取的全部过程, 在封闭操作空间里使用机械对骨骼进行钻取、收集、消毒, 具有安全、快速、无污染、操作简便、成本低等优点, 能为法医物证检验中的新鲜及陈旧骨骼DNA检验提供优质样品。