针对检材的灵敏性, 将全血检测分为两类：一类为未稀释的全血, 分别取全血5、3、1 µ L均匀地涂于棉签头部; 另一类取5 µ L全血分别按照1:5、1:10、1:20、1:50、1:100、1:150、1:250的比例稀释, 而后分别取20 µ L稀释血均匀地涂于棉签头部, 上述按照不同比例稀释的血的实际含量分别相当于全血量的3.3, 2.0, 1.0, 0.4, 0.2, 0.13, 0.08 µ L。自然阴干30 min后, 将两类样本棉签置于检测通道中。

收集不同类型的检材, 包括血斑49份、唾液斑26份、组织(包括肌肉、皮肤、肝脏、脾脏、心脏和脑组织)40份、脱落细胞50份。

系统运行时, 样本自身或彼此转移过程中可能会发生污染, 因此有必要评估其防污染能力。使用空白拭子即未使用过的棉签, 用于检测样本自身或在彼此转移过程中发生污染的可能性（测试空白拭子是否能检出STR真峰, 有检出即发生了污染）。该系统的每次运行都设置空白拭子作检测对照。

血斑来源于8名个体 (分别为A₁、A₂、A₃、A₄、A₅、A₆、A₇、A₈), 分别重复检验次数为2、2、2、4、5、5、6、6; 唾液斑来源于5名个体（分别为B₁、B₂、B₃、B₄、B₅), 分别重复检验次数为2、3、3、3、6; 脱落细胞样本源于2名个体 (分别为C1、C2), 均重复检验2次。对检出的基因座数量进行统计。

上述4种研究方法均采用GlobalFilerTM系统进行检验。

即未稀释的全血与稀释后的全血（在不同稀释比例条件下各取20 µ L）所分别检出基因座数目的比较。全血最低阈值含量的完整基因座检出图谱如图1, 检出情况见表1。

图1

Fig.1

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	图1 全血最低阈值含量的基因座检出完整图谱Fig.1 The complete genetic profiles detected under the lowest threshold of whole blood volume

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 不同全血量的检出情况 Table 1 The detected STR loci numbers under various whole blood volumes 未稀释的全 血含量（µ L） 稀释后的 全血含量（µ L） 5 3 1 3.3 2 1 0.4 0.2 0.13 0.08 检出基因 座数量(个) 24 23 19 23 23 21 11 9 5 5

表1 不同全血量的检出情况 Table 1 The detected STR loci numbers under various whole blood volumes

血斑、组织、唾液斑、脱落细胞检出的等位基因百分比见表2。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 不同类型检材检出情况汇总表 Table 2 Ratio to total amount of each item by the respective item-different samples exposing their STR loci to certain extent 样本类型 检出的等位基因百分比所在不同区间内的样本比例 50%~80% 80%~95% 95%~100% 血斑 0 8.2（4/49） 91.8（45/49） 组织 7.5（3/40） 12.5（5/40） 80（32/40） 唾液斑 0 0 100（26/26） 脱落细胞 60（30/50） 24（12/50） 16（8/50）

表2 不同类型检材检出情况汇总表 Table 2 Ratio to total amount of each item by the respective item-different samples exposing their STR loci to certain extent

本测试Rapid HIT 200系统共设置了100个空白拭子样本, 均未显示发生样本自身或彼此间的污染。

血斑、唾液斑、脱落细胞经不同重复次数的检测, 其基因座一致性检出率见表3。

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 不同样本重复性研究基因座检验结果 Table 3 Reproducible detectivity of the STR loci from the item-various samples 项目 血斑类别 唾液斑类别 脱落细胞类别 A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8 B1 B2 B3 B4 B5 C1 C2 样本重复次数 2 2 2 4 5 5 6 6 2 3 3 3 6 2 2 结果一致性(%) 97.5 95.8 100 98.9 90.8 97.5 99.3 100 100 100 93.1 93.1 97.2 100 94.4

表3 不同样本重复性研究基因座检验结果 Table 3 Reproducible detectivity of the STR loci from the item-various samples

由表1可见, 随着全血量的减少, 无论是未稀释全血, 还是稀释全血, 检出基因座数目都呈递减趋势; 同时尽管稀释后全血实际含量≤ 未稀释全血量, 但检出的基因座数目却是对应稀释后全血≥ 未经稀释全血。这可能是稀释的血液中抑制PCR反应的血红素含量减少所致。此外, 未稀释全血较稀释后血因粘度原因从枪头内不能完全排净, 而使得实际被测血量亦即DNA量减少, 也会使检出基因座数目降低, 或又是另一个原因。通过比较未经稀释和稀释后全血所检出的基因座数目, 推测Rapid HIT 200系统检测血液样本的灵敏度为1 µ L全血, 即模板量30 pg左右。

当检出的等位基因数百分比在95 %~100 %区间时, 血斑、组织、唾液斑样本比例远超半数, 分别为91.8 %、80 %、100 %, 而脱落细胞样本的比例最低, 仅为16 %。这是由于血斑、组织细胞、唾液斑等常量检材的细胞含量大, DNA模板量高, 故基因座数目检出多, 而微量检材脱落细胞数量相对较少, 模板量低, 故检出比例也就少。由此可见, Rapid HIT 200系统对常量检材的检测能力优于微量检材。但是, 检测样本数的不同会影响检出基因座的比率分布区间占比, 比如, 组织样本数为12时, 其检出等位基因百分比区间50 %~80 %的检材数为3（25 %）, 80 %~95 %区间是0, 95 %~100 %区间为9（75 %）; 而对于脱落细胞, 当样本数为30时, 其在50~80%检出等位基因百分比区间的检材数为20（66.7 %）, 80 %~95 %区间是2（6.7 %）, 95 %~100 %则为8（26.7 %）; 与表2其各自检材总数为40和50时所呈现的相应比率分布区间明显不同, 概因低样本数时检材个体差异所导致的统计分布异常使然。因此, 欲得到符合规律和常理的实验结果, 样本总数不能太少。不过, 这些结果恰也证明Rapid HIT 200系统能够准确反映检测样本的真实情况。

在空白拭子中发现一些非特异性谱带, 即非等位基因基线位置出现一些未标记的等位基因, 但是其峰高均低于100 RFU, 显著低于从血拭子中获得的特异性峰高。非特异性谱带有拔起峰、钉子峰等, 这几类峰可采用Gene Marker HID^® V2.6.13软件加以分析删除。对于在黄色和紫色条带的空白拭子中观察到的拔高伪峰, 则可能是在没有相匹配的STR-PCR复制子存在的情况下, 毛细管电泳产生的信号强度过高所致^[9]。因此, 可排除所检测的血拭子有外源性污染的问题。以上结果表明当Rapid HIT 200系统由专业法医学实验人员操作时, 从样本进样到图谱显示, 应不会有污染产生。

对于每一个空白拭子的各荧光条带的峰信号强度要实验确定其分析阈值（Analytical threshold, AT）, 该阈值可用于区别一个真正等位基因峰和基线杂信号。因蓝色通道最小阈值为17RFU、绿色通道10RFU、黄色通道13RFU、红色通道16RFU、紫色通道46RFU, 故针对于所有荧光通道可设AT值为50RFU。

本测试结果表明, 所有实验样本中空白拭子AT值均在50RFU以下; 所有STR分型图谱没有杂峰, 峰高比例均衡, 故样本运行中未发生样本自身或彼此间转移的污染。Rapid HIT 200系统的运行应是防污染的。

血斑、唾液斑和脱落细胞的基因座一致性检出率很高, 均在90 %以上, 可见Rapid HIT 200系统对常见样本的重复性检测性能好。Rapid HIT 200系统运行方便, 具有快速便捷的优点。本测试推测该系统检验血液样本的灵敏度为1 µ L全血, 即DNA模板量30 pg左右, 检测常量检材能力优于微量检材, 具有防污染能力, 对于血斑、唾液斑和脱落细胞等检材均具有很高的重复性。故Rapid HIT 200系统可用于法医DNA快速检测, 但其样本适应性还需进一步改善。