主要仪器及耗材：热致荧光加热设备（公安部物证鉴定中心自主研发设备, 型号：TF-Ⅲ ）、多波段观察拍照设备、佳能单反相机、橙色滤光镜、移液管、电子天平、黑色卡纸、白色复印纸、锡箔纸、载玻片、不锈钢金属面。

试剂：pH=4.7的人工汗液试剂（广东省东莞市科鸿化工有限公司）、氯化钠、蒸馏水、11种氨基酸标准品：甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、脯氨酸、色氨酸、酪氨酸（中国药品生物制品检定所）。

样本处理流程。打开热致荧光加热设备, 设置温度为200 ℃, 选择合适的载物台移动速率, 启动加热纸张样本, 完成后放到多波段观察拍照设备下观察并拍照固定。由于高温反应不可逆, 因此加热温度可以适当低于200 ℃, 如果荧光效果不佳可以再次反复处理。以下对样本的处理均按照本流程进行。

考查承痕客体。选用白色复印纸、锡箔纸、载玻片和金属面作为汗液手印的承痕客体, 志愿者在捺印之前先戴PVC手套5 min以保证汗量充足, 然后分别在4种承痕客体上捺印5枚汗液手印, 为尽量减少汗液手印之间的差异性, 捺印手印时统一停顿3 s并保证用力基本一致。晾干后加热处理观察拍照固定。

考查氯化钠。按照汗液各成分含量配制未加入氯化钠的人工汗液500 mL, 从中取出100 mL加入
0.25 g氯化钠, 用玻璃棒搅拌至全部溶解, 然后用移液管分别取10 μ L未加氯化钠和加氯化钠的人工汗液点滴在白色复印纸的左右, 中间用标记笔做好标记方便比较观察分析, 同样的方法制作3组实验样本。晾干后加热处理并观察拍照固定。

考查氨基酸。分别将11种氨基酸标准品溶于蒸馏水中配制11种浓度为2 mg/mL氨基酸溶液, 分别装入11个离心管中, 并分别做好标记; 同样, 再配制0.2 mg/mL和0.02 mg/mL两组氨基酸溶液。把11种氨基酸的名称用记号笔按照一定的顺序标记于白色复印纸上, 标记完之后使用10 μ L移液管分别提取11种氨基酸溶液点滴到相应氨基酸名称下面, 点滴完后让其自然晾干。三种不同浓度的氨基酸溶液点滴在三张白色复印纸上做成三种不同浓度的氨基酸点滴样本。另外, 将11种0.2 mg/mL浓度的氨基酸分别点滴在相应载玻片上做成实验样本。晾干后加热处理并观察拍照固定。

考查荧光灵敏度。使用移液管分别在白色复印纸上点滴涂抹20、18、16、14、12、10、8、6、4、2、1、0.5 μ L不同量的人工汗液试剂, 并用标记笔分别作上标记。晾干后加热处理并观察拍照固定。

考查氨基酸标准品。将11种氨基酸标准品分别加100 mg到蒸发皿里, 加热处理并观察拍照固定。

实验结果显示锡箔纸、载玻片和金属面上的5枚汗液手印通过加热处理之后都能观察到荧光效果, 且荧光效果也不亚于白色复印纸（图1）。这说明纸张中的成分不影响汗液手印加热产生荧光物质, 荧光物质主要是由汗液里的成分反应生成的。

图1

Fig.1

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	图1 几种不同承痕客体上汗液手印的热致荧光效果Fig.1 thermally-induced fluorescence from sweat fingerprints on several different objects

据相关文献报道, 氯化钠作为汗液中的主要成分之一也可能参与荧光反应^[6], 本实验通过对比分析验证, 结果如图2所示, 三组样本中的加氯化钠与未加氯化钠的人工汗液都出现荧光效果, 且荧光效果几乎都是一样的, 因此, 无论是从化学结构上还是实验现象上进行分析, 氯化钠对汗液荧光效果都是没有促进作用的, 也不参与反应。

图2

Fig.2

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	图2 氯化钠对汗液热致荧光效果影响对比图（左边未加氯化钠, 右边加氯化钠）Fig.2 No influence observed on the thermally-induced fluorescence from the sweat with (right) or without (left) addition of sodium chloride

汗液中的氨基酸含量丰富且种类多样^[7], 实验中以甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、脯氨酸、色氨酸、酪氨酸11种氨基酸为代表进行验证。如图3所示, 通过加热处理后, 11种氨基酸溶液都能观察到荧光效果。其中, 亮氨酸、异亮氨酸、酪氨酸荧光效果较差, 但也能够观察到微弱荧光。从不同浓度的氨基酸荧光效果来看, 2 mg/mL的氨基酸荧光效果明显好于0.2 mg/mL, 0.2 mg/ml同样也好于0.02 mg/mL, 说明单种氨基酸加热也能生成荧光物质, 且荧光效果随氨基酸浓度的降低而逐渐减弱, 即成正比关系。如图4所示, 载玻片上的氨基酸加热后同样都能观察到荧光效果, 这一现象反映了氨基酸加热反应生成荧光物质可以不需要纸张成分参与, 同时也排除了纸张成分对氨基酸反应生成荧光物质的影响。

图3

Fig.3

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	图3 不同浓度氨基酸在白色复印纸上的热致荧光效果(上：2mg/ml, 中:0.2mg/ml, 下:0.02mg/ml)Fig.3 thermallyt-induced fluorescent effect of concentration-different amino acids on white paper (Upper: 2mg/ml, medium: 0.2mg/ml, down: 0.02mg/ml)

图4

Fig.4

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	图4 几种氨基酸在载玻片上的热致荧光效果( 从左到右分别是：甘、苯丙、丝、色、脯氨酸)Fig.4 thermally-induced fluorescence of amino acids on a slide (from left to right: glycine, phenylalanine, serine, tryptophan, proline)

如图5所示, 白色复印纸上汗液热致荧光强度整体上与汗液量成正比, 荧光强度随汗液量的减少逐渐减弱。当人工汗液试剂的量低至4 μ L时荧光效果明显减弱, 1 μ L时荧光微弱, 0.5 μ L时几乎观察不到荧光。因此, 热致荧光成像技术对汗液的荧光显出灵敏度为1 μ L左右。

图5

Fig.5

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	图5 不同量人工汗液在白色复印纸上的热致荧光效果Fig.5 thermally-induced fluorescent effect of amount-different artificial sweat on white paper

如图6所示, 氨基酸标准品直接加热之后都能够观察到荧光, 且荧光效果十分明显, 说明直接对氨基酸标准品加热也可以反应生成荧光物质。加热处理后的荧光物质溶于蒸馏水之后再自然晾干还能观察到荧光, 说明荧光物质易溶于蒸馏水且结构不会发生改变。在实验中需要注意的是控制好加热温度和时间, 如果控制不好将会导致氨基酸要么加热不够没有反应生成荧光, 要么加热过度导致氨基酸碳化变黑且荧光消失。

图6

Fig.6

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	图6 几种氨基酸标准品加热之后荧光效果（从左到右依次是：甘、脯、酪、天冬氨酸）Fig.6 thermally-induced fluorescent effect of several kinds of standard amino acids when heated (from left to right: glycine, proline, tyrosine, aspartate)

通过以上实验可以排除汗液中的大多数成分参与反应生成荧光物质, 并且最终确定是由汗液中的氨基酸反应生成荧光物质。汗液中含有的11种氨基酸通过适当的加热处理都能够产生荧光, 氨基酸无论是溶于蒸馏水中晾干再加热处理, 还是直接加热氨基酸结晶体, 都可以反应生成荧光物质。据有关文献报道, 荧光物质是一类具有刚性结构和π 电子共轭体系的环状化合物, 分子的闭环有利于荧光的产生, 增加分子的共平面性和刚性可以使荧光增强^[8]。氨基酸都具有氨基和羧基, 易发生脱水缩合, 因此, 根据氨基酸自身具有的结构特征及荧光物质的特性, 可以推导出多数氨基酸可能存在的荧光反应, 即两分子的氨基酸脱去两分子水生成稳定的六元环刚性结构^{[9, 10]}。如图7、8、9所示, 以甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸为例进行推导得出其可能的反应过程, 但这仅仅处于推理阶段, 还需要通过相关检验方法进一步验证才能得出准确结论。

图7

Fig.7

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	图7 甘氨酸热致荧光反应方程式Fig.7 Deduction of the heated glycine to produce heat-induced fluorescence

图8

Fig.8

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	图8 丙氨酸热致荧光反应方程式Fig.8 Deduction of the heated alanine to produce heat-induced fluorescence

图9

Fig.9

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	图9 丝氨酸热致荧光反应方程式Fig.9 Evolution of the heated serine to produce heat-induced fluorescence

本文通过实验分别考查了纸张承痕客体及汗液中的几种成分对荧光效果的影响, 确定了纸张不是热致荧光反应的必要条件, 即离开纸张同样也能够产生荧光现象。由此确定了荧光物质可以由汗液中的某种成分通过加热反应生成。氯化钠对汗液的热致荧光效果没有促进作用, 说明氯化钠不参与荧光反应也不会生成荧光物质。汗液中的11种氨基酸加热都能产生荧光效果, 且氨基酸的浓度越高荧光效果越好, 明确了荧光物质主要由汗液中的氨基酸加热反应生成。汗液在白色复印纸上的热致荧光灵敏度是1 μ L, 即汗液量只要大于等于1 μ L就可以观察到荧光现象。实验证明了温度控制在200 ℃左右直接加热氨基酸标准品也能够生成荧光物质, 这为后续研究荧光物质提供了可能性。因此, 在后续的研究过程中可以直接加热氨基酸标准品提取荧光物质。本文从理论上推导出了针对氨基酸可能存在的荧光反应, 得出氨基酸有关的热致荧光反应过程及生成物结构式, 然而这些结论还只是建立在推理的基础上, 后续的研究过程计划先进行系统的氨基酸荧光反应推导, 然后再逐个通过红外光谱、GC-MS以及核磁共振等手段来验证推测机理的可行性, 最终确定准确且完整的热致荧光成像技术的反应过程。