采用ACQUITY UPLC^® HSS T3色谱柱（2.1 mm× 50 mm, 1.8 µ m）（Waters）; 流动相A：0.1 %甲酸水; 流动相B：甲醇; 流速：0.6 mL/min; 梯度洗脱方式见表1所示; 柱温30 ℃; 进样体积2 µ L。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 梯度洗脱条件 Table 1 the conditions of gradient elution 时间 A% B% 0 10 90 0.2 10 90 3.0 90 10 4.0 90 10 4.1 10 90 5.0 10 90

表1 梯度洗脱条件 Table 1 the conditions of gradient elution

电喷雾电离源（ESI）, 正离子扫描; 离子源温度150 ℃; 毛细管电压3.4 kV; 雾化气温度500 ℃; 雾化气流速1 000 L/h。扫描方式采用多反应监测方式（MRM）进行扫描, 离子对为239.99/221.98、239.99/147.99和239.99/165.97。

精密称取沙丁胺醇标准品10.0 mg于10 mL容量瓶中, 加甲醇溶解并定容至10 mL, 制成浓度为1.0 mg/mL的标准储备液。溶液保存在4 ℃冰箱中。

取空白人血浆0.5 mL, 加入2 mL乙腈, 混匀后振荡10 min, 8 000 r/min离心20 min。取上清液过0.22 µ m的滤膜后供LC-MS/MS分析。

精密称取标准品储备液加入空白人血浆中使待测样品浓度分别为1、5、50、100、200、500、1000 ng/mL, 分别进行测定。以峰面积（y）为纵坐标, 以浓度（x, ng/mL）为横坐标作线性回归。回归方程为：y=312.21x-128.15; r²=0.9991。结果表明, 沙丁胺醇在浓度为1~1000 ng/mL范围内峰面积与浓度呈线性相关, 最低检测浓度为0.1 ng/mL。

取空白人血浆0.5 mL, 加入一定量的沙丁胺醇, 制备成沙丁胺醇浓度为5.0、50.0 、500.0 ng/mL的样品, 利用相同的方法处理后供LC-MS/MS检验, 结果三种浓度下沙丁胺醇的回收率分别为76.8 %、85.2 %和93.7 %, RSD分别为1.1 %、2.7 %和7.1 %。利用相同的方法进行测定, 得到三种浓度的日内RSD分别为2.8 %、5.1 %和6.9 %, 日间RSD分别为3.6 %、5.8 %和1.2 %。

将上述制备样品分别于0、1、5、10、24 h进行测定, 以沙丁胺醇峰面积进行计算, RSD为0.52 %。结果表明, 样品在24 h内基本稳定。

沉淀蛋白是一种快速简单且成本较低的前处理方法, 可以使用盐溶液、重金属、酸试剂及有机溶剂等作为沉淀剂, 但是对于质谱检验而言, 前三种会引入新的物质, 影响质谱的检验。本实验中选择利用有机溶剂对水的亲和力来破坏蛋白质外的水键, 使蛋白质在等电点使产生沉淀, 从而达到净化生物检材的目的。本实验考察了乙腈和甲醇两种沉淀剂, 结果表明用乙腈作为沉淀剂的回收率高于甲醇, 且甲醇形成沉淀较为松散, 为絮状型, 易与上清液混合, 从而降低了提取的回收率。乙腈形成的沉淀较为坚实, 为块状型, 附在试管底部。因而本研究选用乙腈作为沉淀剂, 可以有效去除杂质, 使响应灵敏, 干扰变小。

沙丁胺醇是一种极性较强的物质, 使用反相色谱柱可能会导致保留较弱。本文考察了BEH C₁₈、HSS T3、Shield RP18以及HILIC等多种色谱柱, 实验结果表明, 适用HSS T3柱色谱峰型较好, 无拖尾现象, 分离效果好。HSS T3色谱柱特别适用于反相色谱分离中增强对极性化合物和代谢物的保留。这个低配体密度C₁₈色谱柱使分析物能更容易进入颗粒材料的孔结构中, 为极性和疏水性分子提供均衡的保留性能而无需使用离子对试剂, 适用于实验中沙丁胺醇的分离检验。

反相作用色谱一般选用的有机溶剂为乙腈、甲醇和异丙醇, 但在实验具体的操作温度下, 异丙醇的粘度大, 会使柱压过高, 因此实验考察了甲醇和乙腈两种流动相。在水相中, 缓冲盐的种类、浓度及水相的pH值都会影响待测物质的离子化效果, 影响待测物质的保留时间和峰型, 从而影响待测物质检测的灵敏度。

本实验考察了乙腈-水/甲醇、乙腈-水/甲酸胺、乙腈-水/甲酸/甲酸胺、甲醇-水/甲酸、甲醇-水/甲酸胺、甲醇-水/甲酸/甲酸胺体系作为流动相, 缓冲盐甲酸胺浓度为5 mmoL/L, 甲酸的浓度为0.1 %。实验结果表明, 乙腈的分离度和稳定性不如甲醇, 甲醇的峰型较好, 灵敏度较高, 因此选用甲醇作为最终的有机相。通过对比各流动相体系的峰型、出峰时间、分离度及稳定性, 最终选择甲醇-水/ 0.1 %甲酸作为流动相。

质谱条件是利用仪器的自动优化程序进行参数的自动优化, 检测的离子源选择电喷雾电离源（ESI）, 在上述的色谱条件和质谱条件下, 选择多反应离子检测模式（MRM）, 将标准品溶液进样分析, 优化锥孔电压和碰撞能, 选择三对信号强、干扰小的离子对作为定性离子对, 在其中选择响应较高的作为定量离子对。

沙丁胺醇100 ng/mL的标准品溶液在2.2的实验条件下, 采用多反应离子检测模式进样进行分析。分子式为C₁₃H₂₁NO₃, 分子量为239.31, 在样品进入质谱后, 仪器在给定的参数下改变碰撞能量, 通过自动检测程序给出稳定的基峰离子m/z239.99, 基峰离子作为母离子进入二级质谱产生三个子离子碎片m/z221.98、m/z147.99和m/z165.97, 选择其中丰度较高的m/z147.99子离子作为定量离子。