引用本文
钱水, 杜蔚安, 刘超, 杨前勇, 叶俊华. 犬血斑STR直接扩增体系研究[J]. 刑事技术,2016,41(4): 289-291
QIAN Shui, DU Weian, LIU Chao, YANG Qianyong, YE Junhua. Direct Amplification of STRs from Canine Bloodstains[J]. Forensic Science and Technology,2016,41(4): 289-291  
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《刑事技术》编辑部
犬血斑STR直接扩增体系研究
钱水1,*, 杜蔚安2, 刘超3, 杨前勇4, 叶俊华4
1.佛山市公安司法鉴定中心,广东 佛山528000
2.南方医科大学法医学系,广州510000
3.广州市刑事科学技术研究所,广州510080
4.公安部南昌警犬基地,南昌330100

作者简介：钱水（1979—），男，湖南湘乡人，硕士，主检法医师，研究方向为法医物证。E-mail:qshui_jj@163.com

摘要

目的 构建犬血斑DNA的直接扩增体系。方法 依据犬17A STR荧光复合扩增体系（包含基因座DAmel、PEZ1、PEZ2、PEZ3、PEZ5、PEZ6、PEZ8、PEZ12、PEZ15、PEZ20、PEZ21、FH2010、FH2054、FH2079、FH2132、FH2611以及VWFX）,通过优化PCR反应组分和浓度,对犬血斑进行直接扩增,用ABI 3130遗传分析仪检测扩增产物。结果 16个STR基因座和1个性别决定基因座均得到扩增,整体平衡,结果 稳定。结论 优化后的犬17 ASTR基因座荧光复合扩增体系可以对犬血斑进行直接扩增。

关键词: 犬; STR基因座; 血斑; 直接扩增
中图分类号:DF795.2 文献标志码:A 文章编号:1008-3650(2016)04-0289-03 doi: 10.16467/j.1008-3650.2016.04.008
Direct Amplification of STRs from Canine Bloodstains
QIAN Shui1, DU Weian2, LIU Chao3, YANG Qianyong4, YE Junhua4
1. Foshan Municipal Public Security Bureau, Foshan 528000, China
2. Department of Forensic Medicine, Southern Medical University, Guangzhou 510000, China
3. Guangzhou Institute of Criminal Science and Technology, Guangzhou 510080, China
4. Nanchang Police Dog Base, Ministry of Public Security, Nanchang 330100, China
Abstract

Objective To establish a direct amplification system of STRs from canine bloodstains．Methods Based on canine 17A STR fluorescent multiplex amplification system consisting of the loci of DAmel, PEZ1, PEZ2, PEZ3, PEZ5, PEZ6, PEZ8, PEZ12, PEZ15, PEZ20, PEZ21, FH2010, FH2054, FH2079, FH2132, FH2611 and the VWFX, a sex determinant, the PCR was optimized at its reaction components and concentrations, and the STR genotypes of the dog’s samples were detected with ABI 3130 Genetic Analyzer.Results All of the above 17 STR loci have been amplified with overall balance and reliance.Conclusion The optimal canine 17A STR loci fluorescent multiplex PCR system is capable of direct amplification for canine bloodstains.

Keyword: canine; short tandem repeats (STRs); bloodstains; direct amplification

STR复合扩增分析现已成为犬个体识别和亲权鉴定的主要方法, 在犬的档案管理、遗传育种及涉犬案件处理中发挥着重要作用[1, 2, 3]。

犬血斑是目前犬类鉴定最常见的样本来源, 但其含有许多抑制PCR顺利进行的成分[4], 如血红素、血红蛋白及载体杂质等, 因此在进行常规PCR扩增前必须对犬血斑进行DNA提取纯化以除去其中的抑制成分, 但这个步骤将至少需要2~3h, 且过程繁琐又极易污染, 会耗费大量人力物力, 不适合大规模的DNA检测分析。

本研究依据犬17A STR荧光复合扩增体系, 通过优化PCR反应组分配方, 成功克服了上述PCR抑制因素的影响, 可无需经DNA提取和纯化处理便对犬血斑进行直接扩增和检测。

1 材料和方法
1.1 材料

1.1.1 样本

80份犬血斑取自公安部南昌警犬基地, 均在- 20℃保存。

1.1.2 主要仪器

MJ公司PTC200型温度梯度PCR仪, ABI 3130遗传分析仪。

1.1.3 主要试剂

犬17A STR荧光检测试剂盒（无锡中德美联生物技术有限公司产品, 内含2.5× Reaction Mix、5× DPrimers 17A、5U/μ L的热启动C-Taq酶和AGCU Marker SIZ-500）, SSB（单链结合蛋白, 上海晶天生物）和BSA（小牛血清白蛋白, 罗氏生物）。全部试剂均为分子生物学级。

1.2 实验方法

1.2.1 血斑处理

于犬血斑两边浸透区域, 用1.2 mm打孔器取下1片备用。同时采用Chelex-100法[5]提取基因组DNA作为对照。

1.2.2 PCR复合扩增

犬17A STR荧光复合扩增检测体系采用25μ L标准反应设置, 其中含有10μ L Reaction Mix（各组分反应终浓度为10 mmol/L Tris-HCl、50 mmol/L KCl、2.5 mmol/L MgCl2、0.25 mmol/L dNTP Mix）, 5μ L DPrimers 17A引物混合物以及1μ L热启动C-Taq酶, 1片1.2 mm犬血斑样本或2μ L犬基因组DNA, 在反应体系中加入不同浓度的SSB和BSA（表1）, 以水补充至25μ L, 充分混匀后短暂离心。

表1 反应体系中SSB和BSA的反应终浓度 Table 1 Final concentrations of SSB and BSA in reaction solution

1.2.3 PCR扩增程序

95℃预变性2min; 94℃变性1min, 62℃退火1min, 72℃延伸1min, 共10个循环; 90℃变性1min, 60℃退火1min, 72℃延伸1min, 共20个循环; 最后60℃延伸45min。

1.2.4 PCR产物检测及数据收集

扩增产物10000 r/min离心1min, 取1μ L加入到10μ L上样缓冲液中（内含9.5μ L去离子甲酰胺和0.5μ L分子量内标AGCU Marker SIZ-500）, 振荡混匀, 在ABI 3130遗传分析仪上进行毛细管电泳检测, 使用GeneMapperv3.2软件对电泳结果进行分型。

2 结果

犬基因组提取的DNA, 经犬17A STR荧光复合扩增常规体系扩增可以得到完整分型, 而血斑直扩则完全得不到分型结果。但当体系中同时加入SSB和BSA, 随着这两种加入物质的浓度不断提高, 血斑样本各基因座的扩增效率也逐渐提高。在SSB反应浓度达4mg/mL、BSA的为0.3 mg/mL时, 血斑的直接扩增结果达最佳, 各基因座分型均衡, 整体效果与Chelex-100法提取的犬基因组DNA相当（图1）。不过, SSB和BSA浓度再增加, 即便至6 mg/mL和0.6 mg/mL时, 直扩效果却并不再有显著变化。

因而, 可确定犬血斑直扩体系中SSB和BSA的反应终浓度分别为4 mg/mL和0.3 mg/mL。按此对80份犬血斑进行直接扩增, 结果显示16个STR基因座和1个性别决定基因座均得到扩增, 且各个基因座扩增均衡, 无非特异性峰（图2）, 与采用Chelex-100法提取的犬基因组DNA扩增结果没有明显差异。

图1 1.2mm狗血斑随不同SSB和BSA浓度增加的扩增结果（提取的狗基因组DNA不加SSB和BSA的直接扩增结果作为对照）Fig.1 Amplification of the 1.2mm-diameter dog’ s bloodstain with the addition of concentration-different SSB and BSA into its PCR reactions (controlled by the Chelex-100-extracted dog genomic DNA without addition of SSB and BSA)

图2 1.2mm某犬血斑按最佳条件直扩的结果图谱Fig.2 Genotype of one dog’ s 1.2mm-diameter bloodstain subjected to direct PCR amplification under optimal conditions

3 讨论

DNA提取和纯化是STR复合扩增除去PCR抑制剂的最常用方法。相关方法已多有报道[6], 市面上也有很多商业化的试剂盒, 如Promega公司的DNA IQTM系统。但DNA提取纯化是一个极其耗费人力、物力的过程, 而且还会增加样本之间的污染。目前公安机关在建立犯罪人员DNA数据库时均采用商品化的免提取直接扩增试剂盒, 但犬血斑DNA的直接扩增罕有研究和报道。

犬血斑所含的血红素、血红蛋白和载体杂质等非DNA成分会影响DNA聚合酶和模板DNA的结合, 或者因其螯合Mg2+而使DNA聚合酶失去活性, 从而阻止DNA新链[7]的合成。

根据上述抑制剂的作用机理, 本研究在犬STR复合扩增反应体系中加入单链结合蛋白SSB, 由于它可以结合在DNA聚合酶复制叉前的单链区, 从而防止新变性生成的单链DNA复性回双链, 而同时加入的BSA作为一种蛋白保护剂又能抵抗血红素、血红蛋白等杂质对DNA聚合酶的抑制作用, 而维持其热稳定性[4], 故在SSB和BSA这两种添加剂最佳反应浓度下, 犬血斑直扩的PCR抑制因素就被减弱或完全消除, 保证了犬血斑免DNA提取的直接扩增成功实现。

4 结论

本研究经自主构建犬17A STR荧光复合扩增体系, 并在其中加入SSB（终浓度4 mg/mL）和BSA（终浓度0.3 mg/mL）, 实现了犬血斑无需DNA提取的直接扩增, 整体均衡, 结果稳定。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
[1] 李英碧, 吴谨, 侯一平, 等. STR基因座荧光标记复合扩增检测及其法医学应用[J]. 法医学杂志, 2005, 21(2): 96-99. [本文引用:1]
[2] 胡萌, 姜成涛, 叶健, 等. 犬3个STR基因座遗传多态性研究[J]. 中国人民公安大学学报, 2006, 2: 31-33. [本文引用:1]
[3] K. De Munnynck, W. Van de Voorde. Forensic approach of fatal dog attacks: a case report and literature review[J]. Int. J. Legal Med, 2002, 116: 295-300. [本文引用:1]
[4] A. Akane, K. Matsubara, H. Nakamura, et al. Identification of the heme compound co-purified with deoxyribonucleicacid (DNA) from bloodstains, a major inhibitor of polymerase chain reaction (PCR) amplification[J]. J. Forensic Sci. , 1994, 39(2): 362-372. [本文引用:2]
[5] 公安部第二研究所编写组. 法医物证检验技术及应用[M] . 北京: 人民法院出版社, 1997: 333. [本文引用:1]
[6] Burckhardt J. Amplification of DNA from whole blood[J]. PCR Meth. Appl. , 1994, 3: 239-243. [本文引用:1]
[7] Yamamoto Y, Shinozuka T, Kameyama H, et al. DNA typing with drop PCR kit for human blood[in Japanese]. DNA Polymorphism, 1999, 7: 75-78. [本文引用:1]