引用本文
石云杰, 孙溢华, 周如华, 马静. NASS唾液卡在唾液核酸采集中的应用研究[J]. 刑事技术,2016,41(4): 286-288
SHI Yunjie, SUN Yihua, ZHOU Ruhua, MA Jing. Applicability of NASS Card in Collection of Nucleic Acid in Saliva[J]. Forensic Science and Technology,2016,41(4): 286-288  
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NASS唾液卡在唾液核酸采集中的应用研究
石云杰1, 孙溢华1, 周如华1, 马静2
1.苏州市公安局刑警支队,江苏苏州 215131
2.苏州新海生物科技有限公司,江苏苏州 215124

作者简介：石云杰（1980—）,男,陕西佳县人,硕士,主检法医师,研究方向为法医物证。E-mail:120549874@qq.com

基金: 江苏省公安厅应用创新计划项目（No.201201002）
摘要

目的 探讨NASS唾液卡在唾液核酸采集中的应用效果。方法 对NASS唾液卡与FTA唾液卡进行抗菌能力测试和防霉能力测试;使用两种唾液卡分别采集21份人员口腔拭子,通过Identifiler Plus试剂盒进行PCR直接扩增,对STR基因座峰面积进行配对 t检验;使用两种唾液卡各采集1000份人员口腔拭子,通过Identifiler Plus试剂盒复合扩增检测STR分型。结果 抗菌能力测试中NASS唾液卡对大肠杆菌的抑菌率大于99.9 %,FTA唾液卡对大肠杆菌的抑菌率大于94.4 %,对金黄色葡萄球菌、白色念珠菌两种唾液卡抑菌率均大于99.9 %;防霉能力测试中,21天时NASS唾液卡的长霉级别为2级,FTA唾液卡为3级,其他条件下二者无差别;NASS唾液卡和FTA唾液卡对PCR均存在一定程度的抑制,NASS唾液卡在D7S820、D13S317、TPOX、FGA基因座峰面积大于FTA唾液卡（0.01< P<0.05）,在CSF1PO、D2S1338、D18S51基因座峰面积显著大于FTA唾液卡( P<0.01),其余基因座无统计学意义（ P>0.05）;批量检测中,NASS唾液卡检出率为98.3 %,FTA唾液卡检出率为97.9 %。结论 NASS唾液卡在抗菌、防霉能力以及对PCR扩增的抑制程度方面优于FTA唾液卡,适合在唾液核酸采集中应用。

关键词: 法医物证学; 唾液核酸采集; FTA唾液卡
中图分类号:DF795.2 文献标志码:A 文章编号:1008-3650(2016)04-0286-003 doi: 10.16467/j.1008-3650.2016.04.007
Applicability of NASS Card in Collection of Nucleic Acid in Saliva
SHI Yunjie1, SUN Yihua1, ZHOU Ruhua1, MA Jing2
1. Criminal Police Detachment of Suzhou Public Security Bureau, Jiangsu, Suzhou 215131, China
2. Suzhou NuHigh Biotechnology Limited Company, Jiangsu, Suzhou 215124, China
Abstract

Objective To investigate the applicability of NASS card in the collection of nucleic acid in saliva for DNA testing.Methods Anti-bacterial and mildew-proof tests were respectively carried out on NASS and FTA cards. 21 samples of saliva collected individually with NASS and FTA cards were directly amplified with the Identifiler plus kit to measure the peak areas of STR loci, and test was adopted in pairs to compare the corresponding data from the two cards. 1000 samples of saliva collected separately by NASS and FTA cards were directly amplified with the Identifiler plus kit to verify their STR profiles.Results For the anti-bacterial tests, the inhibitory rate of NASS card exceeded 99.9 % against Escherichia coli, and that of the FTA card was less than 94.4 %, with the two cards showing their inhibitory rates greater than 99.9 % against either the Staphylococcus aureus or Candida albicans. On the mildew-proof test, both the NASS and FTA card completely restrained mildew occurring within 14 days. Up to 21 days, the moldy occurrence of NASS card was level 2 and that of the FTA card at level 3. After 28 days passing, the moldy occurrence of the two cards both reached at level 4. The inhibitory effects of the two cards on PCR were observed by their inverse products’ STR loci peak areas, with larger peak areas being obtained from NASS card than those from FTA card (0.01< P<0.05) at STR loci of D7S820, D13S317, TPOX and FGA. Furthermore, the peak areas at CSF1PO, D2S1338 and D18S51 from NASS card ( P<0.01) were significantly greater than those from FTA, though no differences at the other STR loci ( P>0.05). For PCR batch examination, the detection rate of the NASS card was 98.3 % and that of the FTA card was 97.9 %.Conclusion The NASS card showed better performance than the FTA card on their antibacterial and mildew-proof ability as well as the counter-inhibition of PCR, demonstrating it applicable to saliva nucleic acid collection for forensic DNA detection and analysis.

Keyword: forensic biological evidence; NASS saliva nucleic acid card; FTA saliva card

脱氧核糖核酸（DNA）已广泛用于法医鉴定、疾病基因诊断及监测等项目。目前, 最安全、损伤最小的DNA保存方法是采集口腔唾液样品保存至进口FTA唾液卡上, 该方法可在室温条件下长期稳定保存DNA[1]。然而FTA唾液卡价格昂贵, 限制了其对大规模人员样本采集的应用。本研究通过比较国产NASS唾液卡与FTA唾液卡在抗菌与防霉能力以及对PCR扩增抑制程度等方面的表现, 探讨NASS唾液卡在唾液核酸采集中的应用价值。

1 材料与方法
1.1 样本采集

采集1000份刑嫌人员左右两颊粘膜擦拭物, 分别转移至NASS唾液卡（苏州新海生物科技有限公司）与FTA唾液卡（美国 GE-Whatman公司）。

1.2 主要仪器与材料

DHP-9082电热恒温培养箱（上海一恒公司）、Titer Plate shaker恒温振荡摇床（德国 ThermoFisher公司）、ZF-258凝胶成像仪（上海嘉鹏公司）、BSD600-Duet 打孔仪（澳大利亚 BSD公司）、3500XL遗传分析仪（美国 ABI）、9700型PCR扩增仪（美国 ABI）、Identifiler Plus扩增试剂盒（美国 ABI）、测试菌种：大肠杆菌8099、金黄色葡萄球菌ATCC 6538、白色念珠菌ATCC 10231、黑曲霉ATCC 9642、绳状青霉ATCC11797、球毛壳霉ATCC 6205、出芽短梗霉ATCC 15233、绿色黏帚霉ATCC 9645。

1.3 方法

1.3.1 抗菌能力测试

取100 μ L测试菌悬液（大肠杆菌8099、金黄色葡萄球菌ATCC 6538、白色念珠菌ATCC 10231, 回收菌数为1× 104 ~9× 104 cfu）, 分别涂布在大小为2.0 cm× 3.0 cm的NASS唾液卡和FTA唾液卡上, 同时使用空白滤纸卡作为对照; 作用5 min后, 置于5 mL PBS的试管内; 充分混匀, 梯度稀释后, 吸取0.5 mL置于平皿; 用15 mL 营养琼脂培养基（大肠杆菌、金黄色葡萄球菌）倾注培养48 h 、沙氏琼脂培养基（白色念珠菌）倾注培养72 h, 培养温度35 ℃ 士 2 ℃; 抑菌率计算：（对照卡片上的菌落数-测试唾液卡上的菌落数）/ 对照卡片上的菌落数× 100 %; 评价标准：抑菌率≥ 90 %（具有强抑菌作用）。

1.3.2 防霉能力测试

依据ASTM G21-200合成聚合材料防霉性的测定方法：在无菌平皿中注入营养盐琼脂培养基; 凝固后分别将NASS唾液卡、FTA唾液卡、空白滤纸卡, 铺在平板培养基上, 均匀喷洒混合真菌孢子悬液（黑曲霉ATCC 9642、绳状青霉ATCC11797、球毛壳霉ATCC 6205、出芽短梗霉ATCC 15233、绿色黏帚霉ATCC 9645）; 将接种后的平板培养基置于28~30 ℃, 相对湿度85 %以上的条件下培养28 d; 观察可见效果, 记录相应级别。

1.3.3 PCR抑制性测试

使用BSD打孔仪, 分别在NASS唾液卡和FTA唾液卡上取21个直径为0.5 mm的小孔。使用ID Plus扩增试剂盒复合扩增, 扩增体系为9 mL扩增液 + 6 mL 9947A, 扩增循环反应条件：94 ℃变性11 min; （95 ℃, 20 s、59 ℃, 3 min)× 26循环; 60 ℃延伸10 min; 扩增产物使用3500XL型基因分型仪检测。GraphPad Prism软件, 配对t检验, 分析不同唾液卡扩增后, STR基因座峰面积是否有显著差异。

1.3.4 批量测试

采集1000人份左右两颊粘膜擦拭物, 分别转移至NASS唾液卡与FTA唾液卡。使用BSD打孔仪, 打孔直径为0.5 mm。加入15 mL ID Plus扩增试剂复合扩增; 扩增产物使用3500XL型基因分型仪检测。

2 结果
2.1 抗菌能力测试

FTA唾液卡与NASS唾液卡对金黄色葡萄球菌、白色念珠菌均具有较强的抗菌能力, 抑菌率均大于99.9 %; 但对大肠杆菌, NASS唾液卡的抑菌率大于99.9 %, 而FTA唾液卡大于94.4 %。

2.2 防霉能力测试

FTA唾液卡与NASS唾液卡具有较强的防霉能力, 在高温高湿条件下, 14天长霉级别均为0级; 21天NASS唾液卡长霉级别2级, FTA唾液卡长霉级别3级; 28天长霉级别均为4级（见表1）。

表1 两种唾液卡防霉能力检测结果 Table 1 Mildew-proof capability of two cards
2.3 PCR抑制性测试

与阳性对照组相比, ID Plus扩增体系中分别加入取自NASS唾液卡、FTA唾液卡的样品, 电泳结果均有抑制现象(P< 0.01); NASS唾液卡在D7S820、D13S317、TPOX、FGA基因座峰面积大于FTA唾液卡（0.01< P< 0.05）, 在CSF1PO、D2S1338、D18S51基因座峰面积显著大于FTA唾液卡(P< 0.01)（见表2、图1）, 其余基因座无统计学意义（P> 0.05）。

表2 两种唾液卡3个STR基因座峰面积统计结果 Table 2 Statistical data of 3 STR loci peak areas of DNA products from two cards

图1 两种唾液卡3个STR基因座峰面积柱状图^a为阳性对照; b为NASS唾液卡; c为FTA唾液卡Fig.1 Bar graph of 3 STR loci peak areas of DNA products from two cards. (a: positive control; b: NASS card; c: FTA card)

2.4 批量检测

批量使用NASS唾液卡、FTA唾液卡采集1000人份样品, 使用ID Plus试剂盒扩增, 3500XL遗传分析仪电泳。结果表明, NASS唾液卡检出983份样本, 检出率98.3 %, FTA唾液卡检出979份样本, 检出率97.9 %。

3 讨论

采集生物样品并提取其中的DNA, 主要面临三个问题：一是如何灭活样品中可能携带的病原微生物以确保操作者和被检测者的安全; 二是如何有效保存待检生物样品中的DNA, 使之不会破坏; 三是降低使用成本, 扩大应用范围。GE-Whatman公司生产的FTA唾液卡经过强力变性剂和螯合剂浸泡, 纤维基质上含有特殊的化学物质, 当捕捉到细胞后会自动将其裂解, 并与释放出的核酸结合, 从而维持样品中DNA的完整性, 保护核酸免于降解, 不受核酸酶、氧化剂和紫外线影响, 能够阻止细菌和其他微生物的生长, 符合生物样本DNA的采集、保存要求[2, 3]。然而进口产品价格贵, 不利于基层单位大规模使用。

本研究比较了国产NASS唾液卡与FTA唾液卡的抗菌能力, 发现两种唾液卡对金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、大肠杆菌均有很好的抑制作用, NASS唾液卡对大肠杆菌的抑菌率大于FTA唾液卡, 使用中也能确保人员的安全; 先前的研究证实FTA唾液卡在室温下能长期稳定保存DNA, 极少发生霉变现象[2, 3]。因此, 在防霉能力测试中, 实验采用28~30 ℃, 相对湿度85 %以上的极端条件进行加速测试, 结果显示14 d时, 两种唾液卡均有很好的防霉效果, 21 d时NASS唾液卡防霉效果好于FTA唾液卡, 提示NASS唾液卡在实际使用环境中, 防霉能力更好; 由于两种唾液卡均通过抑菌、防霉处理, 因此对PCR扩增都有抑制作用[4]。进一步比较发现NASS唾液卡在D7S820、D13S317、TPOX、FGA基因座扩增抑制性小于FTA唾液卡, 有统计学意义; 在CSF1PO、D2S1338、D18S51等更大片段基因座, 抑制性差异有显著统计学意义, 提示NASS唾液卡更有利于大片段STR基因座的扩增, 更适合直扩试剂的使用; 批量检测证实, 使用两种唾液卡采集DNA, 有效检出率均较高。

综上所述, NASS唾液卡在抗菌、防霉能力, 以及对PCR扩增的抑制程度方面优于FTA唾液卡, 适合在唾液核酸采集中应用。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
[1] 徐飞, 成述儒, 罗玉柱, 等. FTA 卡和普通定性滤纸提取 DNA 方法研究[J]. 生物技术通报 , 2011(11): 221-224. [本文引用:1]
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[4] 匡金枝, 聂同钢, 杨智, 等. FTA-DNA直接提取法的研究与应用[J]. 中国法医学杂志, 2008(2): 108-110. [本文引用:1]