毛细管区带电泳场放大进样检测自来水中季铵盐类除草剂
张庆庆1, 孟品佳1,*, 王燕燕2, 张文芳2
1.中国人民公安大学,北京100038
2.法庭毒物分析公安部重点实验室,北京100192
* 通讯作者:孟品佳(1955—),女,辽宁沈阳人,博士,教授,研究方向为毒物毒品分析。E-mail:mengpinjia@163.com

作者简介:张庆庆(1978—),女,湖北武汉人,博士,讲师,研究方向为法化学。E-mail:897101671@qq.com

摘要

本文建立了毛细管电泳场放大堆积在线富集技术检测自来水中百草枯、敌草快和燕麦枯3种季铵盐类除草剂的方法。采用pH4的200 mmol/L磷酸盐溶液(含体积分数为20 %乙腈)为分离缓冲液,0.5 psi压力下引入去离子水3 s,10 kV电迁移进样30 s,+2 5kV下分离12 min,对3种季铵盐类除草剂进行分离和测定。其中百草枯和敌草快的LOD均达到0.1 ng/mL;百草枯和敌草快线性范围0.25~10 μg/mL,回归系数0.995和0.998。燕麦枯则更适用于压力进样方式,优化条件下,其自来水中检测限可以达到100 ng/mL,0.25~10μg/mL范围内线性回归系数为0.993。3种除草剂的日内精密度和日间精密度均小于8 %和11 %。该方法简单、快速,无需进行样品前处理,且能获得较高灵敏度,可应用于自来水中该类药物的检测。

关键词: 毛细管区带电泳; 场放大样品堆积; 季铵盐类除草剂; 自来水
中图分类号:DF795.1 文献标志码:A 文章编号:1008-3650(2016)04-0265-05 doi: 10.16467/j.1008-3650.2016.04.002
Analysis of Quaternary Ammonium Herbicides in Tap Water by Field-amplified Sample Stacking of Capillary Zone Electrophoresis
ZHANG Qingqing1, MENG Pinjia1,*, WANG Yanyan2, ZHANG Wenfang2
1. People’s Public Security University of China, Beijing, 100038, China
2. Key Laboratory of Forensic Toxicology, Ministry of Public Security, Beijing 100192, China
Abstract

In this paper,we established a capillary zone-electrophoresis analytical method for the determination of three herbicides of paraquat, diquat and difenzoquat in tap water. Capillary electrophoresis (CE) is a popular separation technique for the charged molecules. However, because of the short optical detection length and low sample loading, it has some limitations in terms of sensitivity, thereby restricting its use into a wide range of applications. Much effort has been devoted to address this problem. Sample pretreatment and/or online pre-concentration represent some approaches to increase the sensitivity of CE. Employed the online field-amplified stacking (FASS) injection technique. No sample pretreatment was needed. In this method, a phosphate solution (pH=4.0) containing 20 % acetonitrile was used as separation buffer. After optimization of the key parameters and experimental set-ups, the best stacking efficiency was obtained under these conditions: deionized water to be introduced at first at 0.5 psi pressure for 3s, followed by the introduction of sample solution at 10 kV for 30s. The separation was conducted under 25 kV and completed in 12 min, and the three herbicides were well separated. In the method validation, results demonstrated that paraquat and diquat were given linearity at concentration range of 0.25 -10 μg/mL (coefficient: 0.995 and 0.998), with their LODs of both 0.1ng/mL based on the signal-to-noise ratio of 3:1. For the difenzoquat, the hydrodynamic injection mode was more suitable than FASS mode. Good linear relation was obtained over the scope of 0.25 -10 μg/mL with related coefficient of r2=0.993 and its LOD of 100ng/mL. The intra-day precisions of our method for the three herbicides were all less than 7.5% and those of the inter-dayall below 10.4%. This method is simple, sensitive, able to be used in the rapid detection and determination of quaternary ammonium herbicides in tap water.

Keyword: quaternary ammonium pesticides; capillary electrophoresis; field-amplified sample stacking(FASS); tap water

百草枯(Paraquat, PQ)、敌草快(Diquat, DQ)和燕麦枯(Difenzoquat, DF)3种季铵盐类除草剂近年来被广泛使用, 因其会造成环境污染、人或动物中毒, 在毒物检验中经常涉及。目前, 检测这类农药残留的方法主要有光谱法[1, 2]、气相色谱-质谱联用法(GC-MS)[3, 4]、高效液相色谱法(HPLC)[5, 6]、液相色谱-质谱联用法(LC-MS)[7, 8, 9]、毛细管电泳法(CE)[10, 11, 12, 13]及酶联免疫法(ELISA)[14]等。季铵盐类农药属于极性有机阳离子化合物, 常规气相色谱方法分析困难, 需要进行衍生化处理, 使得分析过程繁琐。毛细管电泳和液相色谱适用于直接分析这类离子化合物。其中毛细管电泳具有仪器简单、操作方便、分离效率高、成本低、消耗少等优点, 但由于进样量和紫外检测器光程的制约, 毛细管电泳-紫外检测通常要使用在线富集技术提高其浓度检测限。场放大样品堆积(Field-amplified sample stacking, FASS)是采用电动进样的在线富集技术, 易于操作, 是通过配制高电阻样品溶液形成高场强区域实现样品堆积, 并通过电动进样引入大体积样品, 提高检测灵敏度。

本文采用毛细管电泳技术考查和优化了3种除草剂的电泳分析条件, 建立了场放大进样区带电泳的分析方法, 可用于自来水中痕量季铵盐类除草剂的检测。

1 材料与方法
1.1 仪器与试剂

BECKMAN P/ACETM MPQ毛细管电泳仪, 配二极管阵列检测器; 未涂层熔融石英毛细管(60.2 μ m× 75 μ m i.d., 有效柱长50 cm, 美国Polymicro Technologies公司)。

百草枯、敌草快、燕麦枯标准品以及紫精二溴乙酯(IS)购于百灵威公司。用万分之一天平称取, 超纯水溶解制备1 mg/mL的百草枯、乙基百草枯、敌草快和燕麦枯标准溶液为储备液, 置于冰箱冷藏室中待用。

试验用磷酸二氢钠、磷酸、甲醇、乙醇、乙腈和异丙醇等均为分析纯试剂, 购于国药集团化学试剂有限公司。配制400 mmol/L的磷酸二氢钠和磷酸溶液, 依据需要配制成pH 2.5~8的20、50、100、150和200 mmol/L磷酸盐缓冲液及含一定体积比有机试剂的磷酸盐缓冲液。实验用纯净水、所用缓冲液及样品溶液均经过0.45 μ m纤维素过滤膜后超声波振荡脱气。

1.2 实验方法

毛细管在第一次使用前依次用甲醇(10 min)、纯净水(10 min)、0.1 mol/LNaOH(20 min)、纯净水(10 min)、缓冲液(60 min)在20 psi压力下冲洗平衡; 两次分析间用缓冲液20 psi压力下冲洗(15 min)。

电泳分析使用背景电解质为含有体积分数为20 %乙腈pH4的200 mmol/L磷酸盐缓冲液, 0.5 psi引入水柱3 s, 10 kV电迁移进样30 s, 施加+25 kV电压, 定量检测波长200 nm, 温度20 ℃。

1.3 方法学确认

定量线性是在空白自来水中分别添加5个不同浓度的标准品和同一浓度的内标溶液, 以待测物峰面积与内标峰面积比值与待测物浓度绘制工作曲线, 线性方程浓度点覆盖范围即为线性范围。

以线性考察的最低点浓度作为待测物的定量限(LOQ), 最小检出限(LOD)为1/3定量限浓度。重复性是在线性范围内低、中、高3个浓度点分别制备5个平行样品进行分析, 以待测物与内标峰面积比值计算日内相对标准偏差(RSD%); 在5天内, 每天在线性范围内低、中、高3点平行测试3个平行样本, 每点共15个数值计算日间相对标准偏差(RSD%)。

2 结果与讨论
2.1 电泳条件的优化

影响毛细管区带电泳(CZE)分离的重要因素主要是电渗流(EOF)的方向及大小, 这受到缓冲液种类、pH值、浓度、有机添加剂种类及比例、温度、分离电压等因素的影响。

分析物PQ与DQ离子分子量相近, 电荷数相同, 电泳淌度十分接近, 不易分离, 本文以PQ与DQ间的分离度作为重要参数对电泳条件进行了详细考查。

2.1.1 缓冲液种类、浓度及pH值考查

通过实验比较了乙酸铵、柠檬酸、硼酸和磷酸盐缓冲液的分离效果, 发现乙酸铵缓冲液的谱图基线不稳, 硼酸分离效果没有磷酸和柠檬酸缓冲液好, 因此选用磷酸盐作为背景缓冲液。

考察了pH在2.5 ~ 8之间、缓冲液浓度在50 ~ 200 mmol/L之间, PQ和DQ间的分离度(见表1)及峰宽、峰高等参数。缓冲液的pH值主要通过管壁上硅羟基的电离影响电渗流。由于季铵盐类除草剂均为阳离子化合物, 其带电状态不受pH的影响。

表1 不同磷酸缓冲液浓度和pH值条件下PQ和DQ间的分离度 Table 1 Resolution of PQ and DQ under the condition of different buffer concentration and pH

考虑到DQ在pH> 9的情况下易分解, DF遇强酸时易氧化分解, 因而缓冲液的pH范围选择在pH3~8的范围内进行考察。随着pH值升高, 电渗流、迁移速度升高, 但当pH值> 7时, PQ和DQ由于与管壁的静电吸附作用使区带明显展宽, 而DF的峰宽随着pH值的升高而减小, 这可能是由于DF净电荷少, 电泳淌度增大, 与毛细管壁上的硅羟基吸附力要小于带有双电荷的PQ和DQ的缘故。季铵盐与管壁的硅羟基产生静电吸附作用会造成样品峰拖尾, 低pH值能抑制硅羟基的电离, 减少吸附从而减小拖尾, 因此选择缓冲液的pH为4。随着缓冲液离子强度的增加, 电渗流减小, 分离时间延长。

另外, 季铵盐类化合物易与未涂层的熔融石英毛细管壁上带负电的硅羟基离子发生离子吸附作用, 而高离子浓度的缓冲液有利于抑制季铵盐与毛细管壁间的吸附作用。实验结果表明, 在磷酸盐缓冲液浓度为20 mmol/L时, PQ和DQ完全不能分离, 随着缓冲液浓度增加两者的分离度变大, 当磷酸盐缓冲液浓度为200 mmol/L时, 可实现完全分离(R> 1.5)。而且随着缓冲液浓度的增加, 各分析物的峰高响应值也在增加, 这也说明缓冲液与样品溶液间的电导率差别是实现场放大富集的主要机制。

2.1.2 有机调整剂、水柱长度和电迁移时间对分离的影响

缓冲液中加入有机调整剂可达到降低缓冲液的粘度、减小电渗流、提高分离度等效果。实验考察了甲醇、乙腈、乙醇、四甲亚砜、丙酮及异丙醇这6种有机添加剂对分离的影响。添加丙酮和四甲亚砜时基线不好, 异丙醇使电渗流降低, 甲醇、乙腈可使溶液黏度变小, 增大电渗流。无论是甲醇还是乙腈对于PQ的峰型影响不大。但甲醇挥发性大, 对缓冲基质影响较大不宜采用, 而低浓度的乙腈对迁移时间的影响很小, 最后选定20 %体积比乙腈的缓冲体系。

本实验中, 在样品和缓冲液间引入了一段水柱。水柱的电导低于缓冲液, 样品随溶液进入后, 由于样品溶液和水柱的电阻大, 形成高电场, 样品离子迅速迁移至水柱与缓冲液的界面, 随后迁移速率降低, 样品在界面处富集。显然水柱的长短将影响分离和富集的效果。压力引进水柱不宜过短, 否则背景电解质中的离子易扩散进入样品区带, 影响富集效果; 水柱过长会因为水的电导率低而影响工作电流的稳定。水柱长度应在1~2 mm之间[15], 实验中0.5 psi引进纯净水, 对比进样时间3~10 s, 在此范围内, 引进水柱长度对分析物峰面积几乎无影响。电迁移进样可实现在大量引入样品体积的同时实现组分的富集, 但也是有限度的。实验表明10 kV电迁移30 s时, PQ和DQ的峰高到达线性最高值, 综合考虑, 选择电迁移30 s。

2.1.3 温度、分离电压对分离的影响

实验结果表明, 在15~40 ℃范围内, 因焦耳热问题, 低温时的分离度、峰高以及峰面积要比高温时要好(见表2)。但是若分离温度低于实验室室温(25 ℃)时, 实验过程中冷凝管上容易凝结水珠, 影响实验进程。因此选择略低于实验室温度的20 ℃为最佳分离温度。

分离电压是样品分离的原动力, 电压越高, 组分迁移越快, 分析时间缩短, 但高于25kV时会导致分离度变差; 当电压低于25 kV时, 峰宽有所增加, 亦影响组分的分离。25 kV时, 10 min内3种季铵盐和内标均出峰, 因此选择用25 kV分离电压(见表3)。

2.2 方法学考查

2.2.1 常规CZE与FASS-CZE方法的比较影响

表4表5分别为用纯净水配制的3种季铵盐类除草剂标准样品在常规区带电泳(CZE)和场放大进样区带电泳(FASS-CZE)的方法学考察结果, 比较表4表5的检测限, 可以看出场放大进样的富集效果比压力进样(常规的区带电泳模式)的灵敏度可提高近1000倍。

表2 不同温度下PQ与DQ间的分离度 Table 2 Resolution of PQ and DQ under the different temperature
表3 不同分离电压对PQ和DQ分离的影响 Table 3 Resolution of PQ and DQ under the different separation voltage
表4 纯净水中季铵盐除草剂压力进样线性方程与LOD Table 4 Regression equation, linear range and detection limit detected by CZE
表5 纯净水中季铵盐除草剂毛细管场放大进样线性方程与LOD Table 5 Regression equation, linear range and detection limit detected by FASS-CZE

在实际样品如自来水中, 由于样品中存在离子杂质, 会对不同组分的检测产生干扰。图1说明了3种季铵盐除草剂在不同模式下的分析效果。在自来水的检测中, DF在低于1 μ g/mL的时候, 基本不成峰型, 高于1 μ g/mL的浓度时峰型也不是很好, 峰型较宽且有拖尾。这可能是因为自来水中成分要比纯净水中复杂, 其中的成分和DF相互间作用, 影响了DF的电迁移(见图1a)。这时用压力进样方式检测自来水中的3种季铵盐除草剂, DF峰形改善, 而且检测限要比电迁移的检测限要低, 可以达到100 ng/mL(见图1b)。因此对自来水中的3种季铵盐进行检测时, DQ和PQ适合场电迁移进样场放大富集方式检测, 而DF适用压力进样的方式进样检测。

2.2.2 自来水中季铵盐的检测

在自来水中添加3种季铵盐类标准品后采用优化条件进行检测, 结果见表6表7。本文中采用的毛细管区带电泳场放大在线富集方法对自来水中的PQ以及DQ的检测灵敏度均很好, 但场放大电迁移进样的方式对自来水中的DF检测灵敏度还不及压力进样方式, 这可能源于自来水中的基质抑制效应。

图1 自来水中标准添加3种季铵盐类除草剂的CZE 谱图。图中数字代表含义:1.PQ; 2.DQ; 3.内标; 4.DF。缓冲体系为pH4的200mmol/L磷酸缓冲液(乙腈20%), 分离条件FASS-CZE为0.5psi× 3s引入去离子水, 10kV电迁移进样30s; CZE为0.7psi× 10s压力进样, +25kV分离12min, 20℃。Fig.1 Electropherogram of the mixture of 3 quaternary ammonium pesticides and the internal standard by capillary zone electrophoresis (CZE)

表6 自来水中季铵盐除草剂的线性方程与LOD Table 6 Regression equation, linear range and detection limit of quats in tap water
表7 自来水中季铵盐除草剂加标后的精密度 Table 7 Precision of the tap water spiked with quats
3 结论

本文建立了自来水中3种季铵盐类除草剂的毛细管电泳分析方法。优化和建立了场放大堆积-区带电泳分析季铵盐类除草剂的条件和方法, 并与常规区带电泳分析结果进行了比较。

毛细管电泳技术分析季铵盐类除草剂, 操作简单, 灵敏度高。其中采用毛细管区带电泳场放大在线富集方法对自来水中的PQ以及DQ的检测灵敏度均很好, 但场放大电迁移进样的方式对自来水中的DF检测灵敏度不及压力进样方式。因此可根据分析的对象选择合适的方法。

The authors have declared that no competing interests exist.

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