引用本文
张勇果, 侯伟光. 甲醛固定胚胎绒毛组织的STR分型[J]. 刑事技术,2016,41(3): 257-258
ZHANG Yongguo, HOU Weiguang. STR Genotyping of the Embryonic Villi Tissue Fixed with Formalin[J]. Forensic Science and Technology,2016,41(3): 257-258  
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《刑事技术》编辑部
甲醛固定胚胎绒毛组织的STR分型
张勇果1, 侯伟光2
1.佛山市公安局刑警支队,广东 佛山528000
2. 济南铁路公安局刑事技术处,济南250000

作者简介： 张勇果（1974—）,男,山西闻喜人,学士,主检法医师,研究方向为法医物证学。 E-mail: 13929928993@139.com

摘要

输卵管妊娠切除组织经甲醛固定2月后送至本单位检验。取两份组织,一份消化液中加尿素、另一份不加尿素消化,以Maxwell™16自动仪提取DNA,Quantifiler定量试剂盒定量DNA浓度,经PowerPlex21系统复合扩增,ABI3130xl遗传分析仪检测分型,通过与嫌疑人的DNA比对,成功确认了胚胎的生物学父亲。根据本案例成功进行DNA提取与STR分型的经验,本文探讨了对甲醛固定的高度降解生物检材提取DNA和STR分型时应注意的事项。

关键词: 法医遗传学; 甲醛固定组织; DNA提取; STR分型
中图分类号:DF795.2 文献标志码:B 文章编号:1008-3650(2016)03-0257-02 doi: 10.16467/j.1008-3650.2016.03.021
STR Genotyping of the Embryonic Villi Tissue Fixed with Formalin
ZHANG Yongguo1, HOU Weiguang2
1.Criminal Investigation Detachment of Foshan Public Security Bureau, Guangdong, Foshan 528000, China
2.Criminal Technology Division of Jinan Railway Public Security Bureau, Jinan 250000, China
Abstract

Formalin-fixed embryonic tissue, excised from tubal pregnancy, was tested after it had been kept in such fixed condition for two months. Two aliquots of the above sample were taken out, being digested of one piece with or without urea addition. DNA was extracted with Maxwell™ 16 auto-equipment, in succession of its concentration being measured by Quantifiler Kit. The genotype was determined by ABI3130xl after the extracted DNA had been undergone the multiplex amplification by PowerPlex 21. The biological father of the embryo was ascertained through comparison with the suspect’s DNA. Based on the case and its successful settlement, a discussion was put upon the DNA extraction and STR test when the sample was badly putrefied out of formalin fixation.

Keyword: forensic genetics; formalin-fixed tissue; DNA extraction; STR genotyping
1 案例

2013年5月, 智障少女谭某被强奸后因输卵管妊娠流产和子宫肌瘤在医院进行了患侧输卵管合并子宫切除术。切除的输卵管用甲醛固定1个月左右送当地公安机关检验, 多次均未得到有效STR分型, 而后送到本单位检验。此时组织已经甲醛固定2个月。

检验过程：将甲醛固定组织放入一烧杯, 用流水冲淋约4 h, 然后用纯水浸泡洗涤3次。将输卵管纵向剖开, 剔除血块后发现少量透明硅胶样的可疑绒毛组织, 将该可疑绒毛组织用纯水浸泡洗涤3次。选择2处可疑绒毛组织, 每处取绿豆大小的2份, 1份加TNE 200 μ L、10 % SDS 20 μ L、20 mg/mLPK 10 μ L、1 mol/L DTT 10 μ L, 另1份按牛青山[1]、谭卓毅[2]的方法多加0.06 g尿素至终浓度为4 mol/L, 56 ℃保温至组织完全消化, 再各加500 μ L裂解液震荡混匀, 然后以Maxwell™ 16仪器提取DNA[3], DNA洗脱体积为30 μ L。样品DNA用Quantifiler法医人类DNA定量试剂盒在ABI7500型荧光定量PCR仪上进行定量, 不加尿素消化的2个样品DNA浓度分别为0.518 ng/μ L和0.372 ng/μ L, 加尿素消化的2个样品DNA浓度分别为0.801 ng/μ L和0.313 ng/μ L。取模板3 μ L以PowerPlex21系统扩增, 扩增体系10 μ L, 28循环, 所得产物用ABI3130xl遗传分析仪检测分型。不加尿素消化的2个样品成功获得性别及20个STR基因座基因型（图1）, 加尿素消化的2个样品则均出现等位基因缺失的现象（图2）, 图3为母体组织基因分型。经与嫌疑人的DNA比对, 成功确认了胚胎的生物学父亲。

图 1 不加尿素消化的甲醛固定胚胎组织STRFig.1 STR genotype of the formalin-fixed embryonic tissue digested without urea

图 2 加尿素消化的甲醛固定胚胎组织STRFig.2 STR genotype of the formalin-fixed embryonic tissue digested with urea

图 3 母体组织STRFig.3 STR genotype of the mother’ s tissue

2 讨论

甲醛是医学和法医病理学实践中最常用的组织固定剂。甲醛固定的组织, 由于甲醛在空气中逐渐被氧化呈现的酸性环境对DNA双链有着极强的破坏性, 导致DNA脆性增加而降解, 并促使DNA碱基与蛋白质间形成亚甲基交联而影响DNA提取效率[1, 2]。据柳燕等[3]报道, 福尔马林固定时间超过15天的组织, DNA大部分降解到250 bp以下, miniSTR也难以获得完整的分型。

本案中甲醛固定2个月的4个组织样品虽然也因DNA降解出现小片断优势扩增的“ 坡形峰” 现象, 但大部分等位基因能够成功检出。究其原因, 一方面是胚胎组织消化前经过充分的淋洗浸泡除去了残存的甲醛, 另一方面是检验人员准备充分, 经过咨询技术专家、查阅文献和反复论证, 采取了合适的方法。磁珠法提取DNA, 可以除去100 bp以下的降解DNA碎片和各种可能干扰PCR的杂质, 纯度高[4]。而对组织采用先加PK、DTT彻底消化再以磁珠提取的方式能提高DNA的获得率[5]。而PowerPlex21试剂盒中最大等位基因不超过450 bp, 有13个基因座的等位基因在280 bp以内, 属于miniSTR。

有文献报道[1, 2]尿素是DNA自然和人工交联最有力的剥脱剂, DTT可还原二硫键, 使与DNA交联的蛋白变性(二硫键还原为巯基), 促进蛋白剥脱, 在甲醛固定组织DNA提取液中加入高浓度(4 mol/L)尿素和DTT可提高DNA提取率。但柳燕等[4]报道采用商业化的磁珠法和硅胶膜法提取甲醛固定组织中的DNA可不加尿素。本案中, 加尿素对磁珠提取DNA的效率未见明显提升, 甚至加尿素的2个样品还出现了等位基因缺失的现象。原因可能是由于样本取材部位、大小及DNA纯化操作的差异性引起。但本案检验样本数量太少, 无统计学意义, 这有待于以后扩大样本量作进一步的分析研究。

实际工作中, 组织都是整块放入甲醛溶液中固定。对于大块的组织, 如果浸泡时间不是特别长, 其中心部位就可能未充分被甲醛浸泡, 因此DNA降解相对轻, 如果采用适合降解检材的DNA提取纯化方法和STR试剂盒, 有可能成功进行STR分型。另外, 经甲醛固定的胚胎绒毛组织, 其性状会发生改变, 透明度、韧度和密度会增加。为保证检出胚胎成分, 有必要多取几处以做对比。本例甲醛固定2个月的胚胎绒毛组织能够成功获得STR分型, 可能得益于：（1）胚胎绒毛组织位于输卵管深部; （2）常温固定1个月左右后进行了冰冻保存; （3）提取前对输卵管组织进行了充分淋洗浸泡; （4）采用了适合降解检材DNA提取纯化的方法和STR试剂盒。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
[1] 牛青山, 辛阳, 林子清, 等. 甲醛固定标本DNA提取及荧光标记STRs复合扩增[J]. 中国法医学杂志, 2003, 18(5): 292-293. [本文引用:3]
[2] 谭卓毅, 丁梅, 王保捷. 福尔马林固定石蜡包埋组织中DNA提取[J]. 法医学杂志, 2006, 22(6): 455-458. [本文引用:3]
[3] 柳燕, 李莉, 赵珍敏, 等. 人体组织在非缓冲福尔马林固定剂中的STR检测时限[J]. 中国法医学杂志, 2010, 25(1): 1-5. [本文引用:2]
[4] 杨电, 刘超, 刘宏. 二次消化结合磁珠法提取腐败组织DNA[J]. 法医学杂志, 2011, 27(6): 441-443. [本文引用:2]
[5] 杨电, 刘超, 徐曲毅, 等. 人体接触检材前处理方式对磁珠法提取DNA效果的影响[J]. 中国法医学杂志, 2011, 26(5): 393-396. [本文引用:1]