作者简介: 朱典(1983—),男,四川宜宾人,硕士,主检法医师,研究方向为法医遗传学。 E-mail:834190@163.com
目的目前涉毒案件中罂粟种属的DNA检验,主要针对的是罂粟叶、籽、根、茎等可获得高纯度DNA的检材,很少涉及罂粟浆液、残根等仅含微量DNA的样本,本文就涉毒案件中罂粟浆液类含微量DNA样本的种属DNA检验方法进行探索。方法使用涉毒案件中的疑似罂粟浆液,分别取悬浮液、离心后上清液以及干燥的沉渣,采用磁珠法提取纯化DNA,使用罂粟种属特异性荧光引物(P14)按照优化的条件进行PCR扩增,并对扩增产物进行检测,对照已知罂粟测序结果确定其种属来源。结果经离心干燥后的沉渣检出了两条清晰的罂粟特异性DNA片段,增加循环次数可提高特异性条带峰值。结论涉毒案件中DNA含量较低的罂粟浆液类检材也可通过DNA检验确定其种属,为日后相关案件中此类检材的种属检验提供参考,具有重要的应用前景。
Objective Current genus identificaiton of poppy in drug cases, is achieved mostly through the DNA testing of the plant’s parts, such as the leaf, seed, root and stalk, which contain large amounts of DNA. Poppy slurry is not a good sample for such kind of DNA testing as it contains only a small amount of DNA. The aim of this study is to explore the method of poppy genus identification through DNA testing of poppy serous fluid and similar samples.Methods The suspected poppy slurry was disposed to obtain its suspension that was further centrifugated to separate into the supernatant and sediment. The sediment was dried and grinded into powder. From the suspension, supernatant and powdered sediment, DNA was respectively extracted and purified by using the magnetic beads method. PCR amplification was carried out with poppy specific fluorescent primers (P14) under optimized conditions, and the amplification results were detected by gel electrophoresis. Finally, the genus identification was achieved by comparing the results with a known poppy control sequence.Results Two specific DNA fragments were clearly identified from the sediment group, and the peak values of specific bands increased with PCR cycle number ascending.Conclusions The genus of poppy slurry can be identified through its DNA testing, and the result shows a practical value in drug related cases, suggesting a new choice for the genus determination of toxic plant by testing the DNA of its slurry.
基于DNA检测技术建立的罂粟种属鉴别系统[1, 2, 3, 4]已能准确对幼苗期罂粟、罂粟植株残渣、罂粟壳和罂粟种子进行鉴定, 如今已广泛应用于基层涉毒案件毒品原植物的检验, 为案件侦破提供了有力的证据[5]。然而, 随着涉毒案件送检的检材越来越多样化, 疑似罂粟浆液、残根等含微量DNA的罂粟植株样本的种属检验, 成了目前毒品原植物鉴定的重点及难点。本文针对实际案例中提取到的疑似已兑水欲贩卖的罂粟浆液, 初步探索此类疑难检材DNA种属检验方法的优化, 以期对日后毒品原植物的鉴定提供有价值的参考。
从实际案件中提取的疑似已兑水的罂粟浆液1管, 约300 mL, 呈黑褐色悬浮液状。
样本预处理:将罂粟浆液混匀后, 取300 µ L悬浮液置于1.5 mL离心管内备检; 剩余悬浮液3000 r/min离心5 min, 取300 µ L上清液于1.5 mL离心管内备检, 去除剩余上清液将沉渣均匀涂抹于载玻片上, 干燥后研磨成粉, 取适量置于1.5 mL离心管内备检。
DNA提取:使用Magattract® M48 DNA Manual kit(Qiagen公司, 德国)提取纯化DNA, 具体操作如下:分别向悬浮液、上清液、沉渣粉末中加入300 µ LG2裂解液及30 µ L蛋白酶K(5 mg/mL), 置于恒温孵育器上56℃过夜。13000 r/min离心3 min, 取上清液加入900 µ L吸附液(MTL)和30 µ L磁珠, 翻转吸附10 min, 上磁力架去除液体成分, 80 %乙醇洗涤3次后烘干, 加入去离子水40 µ L, 65℃保温10 min, 在磁力架上将液体分别转移至0.5 mL离心管备用。
PCR扩增:应用罂粟种属特异性SSR(simple sequence repeat, 微卫星标记)荧光引物(P14)进行PCR扩增[5], 分4组进行:第1组, 分别取上述纯化后DNA模板1 µ L, 加入19 µ L反应体系, 94 ℃预变性2 min, 94 ℃变性30 s, 55 ℃退火30 s, 68 ℃延伸30 s, 循环26次, 68 ℃终延伸30 min, 4 ℃保温待检; 第2组, 取沉渣纯化提取的DNA模板, 分别稀释10倍、20倍后各取1 µ L按第一组条件扩增待检; 第3组, 分别取沉渣纯化提取的DNA模板1、2、4 µ L, 按第一组条件扩增待检; 第4组, 分别取沉渣纯化提取的模板1 µ L, 在不同循环次数(26、27、28次)下扩增待检。
荧光检测:使用ABI-3500型遗传分析仪(Thermer Fisher公司, 美国)进行荧光检测, 并与已知罂粟样本、空白样本进行比对。
经兑水的罂粟浆液, 不同于其叶、籽、根、茎等检材, 不易通过研磨破壁及磁珠纯化获取高纯度的DNA, 属于微量DNA检材, 种属检验难度大, 目前尚无针对性研究。本实验的初步探索, 可为此类疑难检材的种属DNA检验提供一些参考。
首先, 罂粟在割浆的过程中, 不可避免地将少量罂粟壳带入浆液, 为浆液的种属DNA检验提供了基础。但由于残留的罂粟壳量少且分散, 故罂粟浆液(即本研究中的悬浮液)直接检验很难获得有效结果, 而通过离心对富集的沉渣进行检验, 则能提高检验成功率(见图1)。其次, 鉴于植物细胞壁的存在, 需对浆液沉渣进行涂片干燥研磨破壁后检测, 另外研磨获得的粉状残渣也可增大与消化裂解液的接触面积, 释放更多DNA。但是研磨后的残渣粉末经磁珠纯化提取到的DNA模板量少且含色素, 故稀释或加量扩增时均未获得有效结果, 因此, 在此类检测中应选择合适的扩增模板量。最后, 适当增加扩增循环次数可提高所检测的特异性片段峰值, 更利于结果的判读。
本次实验还发现:罂粟浆液沉渣为黑褐色物质, 含大量色素成分, 磁珠纯化后仍明显残留于DNA模板中, 色素对后续DNA扩增具有一定的抑制作用; 另外, 罂粟悬浮液及沉渣DNA检测结果中均可见197bp大小的一条特异性条带, 该条带出现的位置既不同于罂粟, 也不同于罂粟近源植物虞美人(206bp)[5], 不能确定其来源, 考虑该罂粟浆液中可能混杂其它植物成分。针对上述问题尚需进一步研究。
The authors have declared that no competing interests exist.
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