引用本文
李祎, 舒科, 申秀华, 骆大晶. 高效液相色谱 -飞行时间质谱用于琥珀胆碱的快速检测[J]. 刑事技术,2016,41(2): 120-122
LI Yi, SHU Ke, SHEN Xiuhua, LUO Dajing. Rapid Determination of Succinylcholine by High Performance Liquid Chromatography-Quadrupole Time of Flight Mass Spectrometry[J]. Forensic Science and Technology,2016,41(2): 120-122  
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高效液相色谱 -飞行时间质谱用于琥珀胆碱的快速检测
李祎, 舒科, 申秀华, 骆大晶
浙江省金华市公安局司法鉴定中心,浙江 金华321000

作者简介：李祎,初级工程师,硕士研究生,研究方向为毒物检测。 E-mail:jhliyi@163.com

摘要

目的 建立一种快速检测琥珀胆碱的方法。方法 血液样品经过乙腈沉淀蛋白后,以0.22 μm滤膜过滤,利用高效液相色谱 -飞行时间质谱联用仪检测毒狗针及狗血中琥珀胆碱成分。选用Kinetex 2.6 μm HILIC（100 mm×2.1 mm）并前接保护柱,以5 mmol醋酸铵90 %乙腈水溶液和200 mmol醋酸铵0.4 %甲酸水溶液作为流动相,进行等度洗脱分离。结果 前处理简单快速,检测时间仅需5 min。采用的定性定量离子其精确分子量为145.109 3Da。测得血液样品中琥珀胆碱的检测限为0.9 ng/mL(S/N=10),方法的线性范围为0.01~10 μg/mL。 结论 该方法准确可靠、简便快速,具有良好重现性,是琥珀胆碱的一种有效检测方法。

关键词: 高效液相色谱 -飞行时间质谱; 琥珀胆碱; 快速检测
中图分类号:DF795.1 文献标志码:A 文章编号:1008-3650(2016)02-0120-03 doi: 10.16467/j.1008-3650.2016.02. 009
Rapid Determination of Succinylcholine by High Performance Liquid Chromatography-Quadrupole Time of Flight Mass Spectrometry
LI Yi, SHU Ke, SHEN Xiuhua, LUO Dajing
Judicial identification center, Jinhua Municipal Public Security Bureau, Zhejiang, Jinhua 321000, China
Abstract

Objective Succinylcholine, a short-acting agent to depolarize skeletal muscle, is currently used in anesthesia for its fast activation, being frequently chosen to poison dogs by culprits making their hitting darts daubed with it. Therefore, its residues in dog body will be harmful for the people who eat the dog meat. This paper aimed at establishing methods for the detection of succinylcholine in biological samples.Methods Aliquots of 2 mL human blood samples containing succinylcholine were prepared for analysis. Succinylcholine was extracted from human plasma with only two steps by acetonitrile to precipitate protein and the 0.22 μm filtering membrane to conduct filtration. The samples were separated by high performance liquid chromatography through a Kinetex 2.6 μm HILIC (100 mm×2.1 mm) column of Shimadzu 30A. The liquid chromatography-mass spectrometry was carried out by selection of isocratic elution, salinity and acidity of mobile phase together with the optimization of mass spectrometry. The mobile phases were consisted of acetonitrile (diluted to 90 % with the buffer of 5 mmol/L ammonium acetate, designated as A) and 200 mmol ammonium acetate/0.4% formic acid (B), running at the flow rate of 0.5 mL/min.Results The detection was completed within 5 min, the precise molecular weight of ion selected for qualitative and quantitative was 145.1093Da. By stepwise dilution, the measured quantitative detection limit was 0.9 ng/mL (S/N=10) in blood, and the linear range was from 0.01 to 10 μg/mL.Conclusions This method is accurate, reliable, simple, rapid and repeatable, and can be applied to the forensic toxicological analysis.

Keyword: HPLC-QTOFMS; succinylcholine; rapid determination

琥珀胆碱是一种骨骼肌松弛药, 在临床上多用于局部麻醉, 可引起心动过缓、心律失常、心搏骤停等, 属国家一类管制药品。常有偷窃犯使用此类药品[1, 2, 3], 以涂有琥珀胆碱的飞镖掷击而毒害妨碍他们作案的狗。由于毒死的狗体内会残留琥珀胆碱, 食用这些狗肉的人们就将面临安全隐患。目前, 越来越多的理化工作者研究琥珀胆碱的检测, 其常见检测方法有离子色谱法 [4, 5]、荧光分光光度法 [6]、气质联用法以及液质联用法等 [7, 8, 9, 10, 11]。上述这些方法存在前处理复杂、检测限高等方面的问题。本文报道一个用高效液相色谱-飞行时间质谱联用仪检测琥珀胆碱的快速分析方法。

1 材料与方法
1.1 仪器与试剂

SHIMADZU超高效液相色谱仪, 色谱柱：Kinetex 2.6 μ m HILIC（100 mm× 2.1 mm）, 前接相同填料的保护柱; AB SCIEX Triple TOF4600飞行时间质谱仪; 高速离心机（最大转速11000 r/min）; 0.22 μ m滤膜。

乙腈、甲酸（均为色谱纯）, 去离子水（经Millipore纯水系统制备）。醋酸铵固体（CNW科技有限公司）, 氯化琥珀胆碱标准品（98 %, 梯希爱（上海）化成工业发展有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 标样制备

配制琥珀胆碱1.0 mg/mL甲醇标准溶液, 并稀释到100 μ g/mL, 储存于装有塑料衬管的进样瓶中, 用于实验条件优化。

分别添加0.01、0.02、0.05、 0.10、1.00、10.00和100.00 μ g的琥珀胆碱于1 mL血液中, 进行检测方法线性范围和检测限实验。

1.2.2 液相条件

色谱柱：Kinetex 2.6 μ m HILIC（100 mm× 2.1 mm）, 前接保护柱; 柱温：45 ℃; 流动相A:流动相B为40:60; 进样量5 μ L; 流速0.5 mL/min; 等度洗脱。

上述流动相A为5 mmol醋酸铵、90 %乙腈水溶液, B为200 mmol醋酸铵、0.4 %甲酸水溶液。

1.2.3 质谱条件

电喷雾离子化源（ESI+）正离子方式检测; MS扫描方式：TOF MS; MS/MS扫描方式：IDA（动态背景扣除）模式; 质谱参数：GS1：50、GS2：55、CUR：35、扫描范围为50~500 DA, 雾化电压（ISVF）5 500 V, 雾化温度500 ℃, 去簇电压（DP）60 V, 碰撞能量（CE）10 eV, 扫描时间5 min。由于琥珀胆碱为双电荷分子, 其单电荷母离子精确分子量为145.1093 Da、子离子精确分子量为86.096 2 Da, 母离子的强度大, 所以选择145.1093 Da作为定性定量离子, 采用IDA模式。

1.2.4 检材前处理

取被检血2 mL置于离心管中, 加入10 mL乙腈溶液, 高速离心, 过0.22 μ m滤膜, 取滤液200 μ L转入装有塑料衬管的进样样品瓶中, 待超高效液相色谱-飞行时间质谱进行检测。

2 结 果
2.1 盐度的影响

由于流动相A为通用流动相, 且该体系为恒流体系, A、B相的比例固定, 因此本文主要通过改变流动相B来实现流动相的优化。图1为同样浓度标样使用相同酸度不同盐分的提取离子图（提取离子范围145.10~145.11）。该图中四种流动相中醋酸铵的含量自右向左依次升高, 通过比较峰的各项指标可以发现, 盐分的增加可以降低半峰宽, 减少毛刺, 提高峰的强度, 而过高的盐分可能对质谱端以及HILIC柱的寿命产生不良影响, 因此通过实验验证, 本文选择了200 mmol作为流动相B中盐的含量。

图 1 不同盐分（自右向左10、20、50和200 mmol醋酸铵）流动相中琥珀胆碱提取离子图Fig.1 Chromatography of the extracted succinylcholine ion with different salinity (10, 20, 50, 200 mmol of ammonium acetate from the right to the left) in mobile phase

2.2 酸度的影响

比较不同盐度、不同酸度流动相下的提取离子图, 选择最优条件。以图2中50 mmol醋酸铵下甲酸含量分别为0.1 %、0.2 %、0.3 %为例, 酸度越高, 峰宽越窄, 保留时间提前, 强度更大。酸度的增加也要考虑到柱子的耐受性, 从图2中200 mmol醋酸铵下甲酸含量达到1.1 %时, 流动相pH约为3.15, 此时虽然峰型相对对称, 峰宽较窄, 强度也达到最高, 但是可以看到, 出现一些杂峰, 这些杂峰应来自于柱流失, 因此, 酸度虽然能提高柱效, 但出于保护柱子, 应合理选择, 本文通过200 mmol醋酸铵下不同酸度实验, 得出200 mmol醋酸铵0.4 %甲酸为最佳流动相条件。

2.3 线性范围、检测限和精密度

在1mL血液样品中添加琥珀胆碱标准品分别配制成0.01、0.02、0.05、0.10、1.00、10.00和100.00 μ g/mL的琥珀胆碱标准液, 仪器进样5 μ L分析。以标准溶液浓度为横坐标, 色谱峰面积为纵坐标做线性回归, 得到其方程：y=909.51022x-57.20633, 相关系数为r2=0.99362, 测得琥珀胆碱使用该方法的线性范围为0.01~10.00 μ g/mL。5次连续进样的标准偏差小于5 %。

分别通过对1.2.4方法制备的检材进行逐级稀释, 测得该方法在血液基质中的检测限为0.9 ng/mL(S/N=10), 完全能够满足毒狗案中的琥珀胆碱检测。

图 2 琥珀胆碱在200 mmol醋酸铵(a)不同酸度（甲酸含量自右向左0.2 %、0.4 %、1.1 %, 其中上图嵌入图为0.2 %的情形）以及50 mmol醋酸铵(b)不同酸度（甲酸含量自右向左0.1 %、0.2 %、0.3 %）流动相的提取离子图Fig.2 Chromatography of the extracted succinylcholine ion with different acidity of both 0.2 %, 0.4 %, 1.1 % (the embedding graph for the case as 0.2 %) and 0.1 %, 0.2 %, 0.3 % from the right to the left at the respective 200mmol (the upper part of this Fig.) and the 50 mmol ammonium acetate (the under part of this Fig.) in mobile phase

2.4 典型案例

2015年在浙江省永康市查获大量冰冻疑似毒狗肉。经对送检的适量该冰冻疑似毒狗肉于室温下融化, 分离并收集含狗血的液体2 mL置于离心管中, 按前面1.2.4所述方法处理检材并以建立的优化条件进行超高效液相色谱-飞行时间质谱检测, 结果如图3所示, 证实送检疑似毒狗肉确实含有高强度的琥珀胆碱。本文方法现已常规应用于作者单位日常案件琥珀胆碱的检测中。

图 3 疑似毒狗肉融化血性液体以优化条件（200 mmol醋酸铵, 0.4 %酸度）提取的琥珀胆碱离子图谱Fig.3 Chromatography of the extracted succinylcholine ion from the fleshes of dogs suspected to poison to death in one case under optimized conditions (200mmol ammonium acetate and the acidity of 0.4 %)

3 讨 论

(1) 通过对不同酸度以及不同盐度流动相的试验比较, 发现酸度、盐度越高, 柱效越好, 但考虑柱子本身的局限性以及质谱的抗干扰程度, 酸度和盐度不能无限提高。

(2) 以往飞行时间质谱多用于定性, 人们往往不重视其在定量方面的能力, 认为定量只能依靠使用母离子/子离子对的多级质谱来实现。本文实验结果表明, 飞行时间串联质谱仪能够满足一定的定量要求, 结合其强大的定性能力, 适当情况下能够满足实验室同时定性定量检测的需求。

本文方法较以往处理手段更快速准确, 其前处理步骤更简单, 而且其检出限远远超过了实验要求。利用飞行时间质谱的高分辨性, 一次检测就可以进行准确的无标样筛查, 并可根据需要, 选取筛选目标物的高分辨二级扫描质谱图作确证。该方法通用性强, 漏错检可能性低, 可与其他常见毒物同时筛查。

The authors have declared that no competing interests exist.

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