气相色谱-质谱联用仪（Thermo ITQ1100）、色谱柱：DB-FFAP (Agilent 60 m× 0.25 mm × 0.25μ m)、自动进样器（Thermo TRIPLUS RSH）;

试剂：乙醇（分析纯, 北京国药集团化学试剂有限公司）、乙酸正戊酯（色谱纯, 上海西格玛奥德里奇贸易有限公司）, 棕榈酸乙酯、油酸乙酯、亚油酸乙酯（色谱纯, 均购自德国Dr. Ehrenstorfer公司）。

离子源温度：220 ℃; 进样口温度：230 ℃; 载气：氦（He）; 流量：1.0 mL/min;

传输线温度：250 ℃; 进样量：1μ L 分流比：30:1;

色谱柱升温程序：初始温度50 ℃, 保持2 min, 以2 ℃/min的速率升温至120 ℃, 保持2 min; 再以6 ℃/min的速率升温至170 ℃, 保持2 min; 继续以10 ℃/min的速率升温至220 ℃, 保持20 min。

2.1.1 色谱柱选择

白酒中极性组分相对较多, 因此本实验选择TR-5MS（中等极性）、CP-Wax57（极性）和DB-FFAP（极性）3根常用于白酒分析的毛细管柱对酒样进行分析。实验设定载气流速为1.0 mL/min; 分流进样, 分流比为30:1; 进样量1μ L。升温程序根据不同色谱柱性质和特点分别设定。3种不同色谱柱分离效果比较如图1。

其中TR-5MS毛细管柱属弱极性柱, 固定液为5 %苯基 + 95 %甲基聚硅氧烷, 对极性成分作用力较弱^[6]。因此, 在使用TR-5MS毛细管柱时, 组分保留时间普遍偏小, 且出峰集中在色谱图前半部分, 致使各组分之间的分离效果较差; CP-Wax57与DB-FFAP色谱柱均为聚乙二醇类色谱柱, 极性强, 其色谱图出峰位置较分散, 分离效果较好。经比较, DB-FFAP毛细管柱分离效果更好, 因此本实验采用DB-FFAP毛细管柱。

图 1

Fig.1

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	图 1 3种不同色谱柱分离效果比较（a:TR-5MS:b:CP-Wax57:c:DB-FFAP）Fig.1 Comparison of the separation efficiency of three different chromatographic columns (a: TR-5MS; b: CP-Wax57; c: DB-FFAP)

2.1.2 升温程序优化

程序升温主要用于分离一些宽沸程的化合物。利用程序升温分离分析, 能够使混合物中沸点不相同的组分在最佳温度下被洗脱下来, 改善分离效果, 缩短分析时间^[7]。本实验分别考察了在2、3、6、8、10 ℃/min升温条件下白酒的分析效果, 在保证分离效果的前提下尽量缩短分析时间, 最终确定升温程序为：初始温度50 ℃, 保持2 min, 以2 ℃/min的速率升温至120 ℃, 保持2 min; 再以6 ℃/min的速率升温至170 ℃, 保持2 min; 继续以10 ℃/min的速率升温至220 ℃, 保持20 min。

2.1.3 载气流速优化

本实验采用氦气作为载气。载气流速大小对实验结果有着重要影响, 流速不同会造成分离程度的不同。载气流速小, 分离较为充分, 但是会导致灵敏度降低; 载气流速大能够充分提高灵敏度, 缩短实验进行时间, 但是会导致样品物质流失, 造成分离不充分^[8]。
本文考察了流速分别为0.8、0.9和1.0 mL/min时, 其对分离效果的影响。随着载气流速加大, 物质保留时间略有缩短, 在保证不影响分离效果的情况下, 实验采用载气流速为1.0 mL/min。

2.1.4 分流比优化

分流比影响出峰个数与分离效果：分流比越大, 实际检测到的组分量越小, 谱图越清晰, 但分流过多, 将造成相对低含量组分的严重流失, 引起进样歧视^[9]。
本实验分别测试了进样量为1μ L时, 分流比为20:1、30:1、40:1时的分离效果。结果显示, 随着分流比的加大, 各组分峰面积逐渐减小。综合考虑样品浓度和色谱柱容量的因素, 最终选定分流比为30:1。

2.2.1 目标物质单独定性分析

将棕榈酸乙酯、油酸乙酯、亚油酸乙酯标准品分别单独进样, 得到3种标准品的总离子流色谱图。每种样品平行进样3次, 得到3种组分的大致保留时间。在该实验条件下, 棕榈酸乙酯的保留时间为56.95 min; 油酸乙酯的保留时间为61.55 min; 亚油酸乙酯的保留时间为62.84 min, 保留时间的相对偏差不大于1 %。

2.2.2 目标物质混合定性分析

棕榈酸乙酯、油酸乙酯、亚油酸乙酯标准品混合进样, 得到总离子流色谱图如图2。由图2可知3种成分可以有效分离, 互不干扰, 混合进样与单组分进样保留时间的差距不超过0.01 min。

图 2

Fig.2

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	图 2 棕榈酸乙酯、油酸乙酯、亚油酸乙酯混合溶液总离子流色谱图Fig.2 The TIC of mixture solution of ethyl palmitate, ethyl oleate and ethyl linoleate

图 3

Fig.3

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	图 3 白酒酒样总离子流色谱图Fig.3 The TIC of the sampled liquor

2.2.3 实际样品中目标物质定性分析

取某品牌白酒酒样, 不进行预处理直接通过GC-MS进样, 得到白酒酒样总离子流色谱图如图3。56.95、61.55、62.85 min处出现疑似棕榈酸乙酯、油酸乙酯、亚油酸乙酯色谱峰, 将该色谱峰的相应质谱图与标准样品质谱图比对, 再通过NIST谱库(NIST MS SEARCH 2.0)进行检索匹配确保准确性。以棕榈酸乙酯为例, 图4为白酒酒样中疑似棕榈酸乙酯的目标峰质谱图; 图5为棕榈酸乙酯标准品质谱图; 图6为NIST谱库中检索出的棕榈酸乙酯质谱图。

图 4

Fig.4

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	图 4 白酒酒样中疑似棕榈酸乙酯物质质谱图Fig.4 The mass spectrogram of ethyl-palmitate-like substance in the sampled liquor

图 5

Fig.5

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	图 5 棕榈酸乙酯标准品质谱图Fig.5 The mass spectrogram of ethyl palmitate, the standard substance

图 6

Fig.6

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	图 6 NIST谱库中棕榈酸乙酯质谱图Fig.6 The mass spectrogram of ethyl palmitate in NIST

将酒样中疑似棕榈酸乙酯组分的质谱图与棕榈酸乙酯标准品质谱图进行比对, 其特征离子碎片及丰度比与标准品一致, 与NIST谱库中棕榈酸乙酯质谱图比对可得到相同结论, 因此判断该物质为棕榈酸乙酯。同理, 可判断61.55 min、62.85 min处色谱峰分别为油酸乙酯、亚油酸乙酯。故白酒酒样中含有棕榈酸乙酯、油酸乙酯、亚油酸乙酯, 该分析方法真实有效。

2.3.1 内标标准曲线

考虑到不同化合物在同一条件下、同一检测器上的响应因子往往不同, 采用内标法引入内标标准曲线来矫正误差, 以期获得更为准确的定量结果。

分别准确配制棕榈酸乙酯、油酸乙酯、亚油酸乙酯100 µ g/mL储备液, 3种溶液配制方法相同, 以棕榈酸乙酯为例：量取10 mg棕榈酸乙酯标准品, 用无水乙醇稀释定容至100 mL, 配制成100 µ g/mL棕榈酸乙酯储备液。然后将3种物质储备液分别稀释至1、5、10、20、25 µ g/mL, 进样前分别加入等量内标。内标选择2 % (v/v)乙酸正戊酯, 用无水乙醇稀释定容。以浓度为横坐标, 样品峰面积与内标峰面积的比值为纵坐标, 绘制棕榈酸乙酯内标标准曲线。

油酸乙酯、亚油酸乙酯内标标准曲线绘制方法与棕榈酸乙酯相同。所得3种物质内标标准曲线线性回归方程、相关系数见表1。3种物质内标标准曲线相关系数均大于0.99, 可用于白酒样品的定量分析。

表 1

Table 1

表 1(Table 1)

表 1 棕榈酸乙酯、油酸乙酯、亚油酸乙酯线性回归方程及相关系数 Table 1 The linear regression equations and the correlation coefficients (r2) of ethyl palmitate, ethyl oleate and ethyl linoleate 棕榈酸乙酯 油酸乙酯 亚油酸乙酯 线性回归方程 y = 0.046x + 0.0125 y =0.0477x- 0.0523 y =0.0415x-0.0364 相关系数r2 0.9994 0.9944 0.9964

表 1 棕榈酸乙酯、油酸乙酯、亚油酸乙酯线性回归方程及相关系数 Table 1 The linear regression equations and the correlation coefficients (r2) of ethyl palmitate, ethyl oleate and ethyl linoleate

2.3.2 检出限、定量限及加标回收率测定

将记录测得的被测样品信号强度S与噪音（或背景信号）强度N求比值, S/N=3时样品最低浓度为检出限（LODs, S/N=3）; S/N=10时样品浓度为定量限(LOQs, S/N=10)。3种物质检出限及定量限见表2。

表 2

Table 2

表 2(Table 2)

表 2 棕榈酸乙酯、油酸乙酯、亚油酸乙酯的加标回收率、检出限、定量限 Table 2 The spike recoveries, limits of detection (LODs) and limits of quantification (LOQs) of ethyl palmitate, ethyl oleate and ethyl linoleate 理论加入浓度 (µ g/mL) 实际浓度平均值 (µ g/mL) 加标回收率 (%) 检出限 (µ g/mL) 定量限 (µ g/mL) 棕榈酸乙酯 11.42 12.35 108.11 0.07 0.7 油酸乙酯 9.33 8.98 96.20 0.09 0.9 亚油酸乙酯 9.17 8.68 94.68 0.11 1.1

表 2 棕榈酸乙酯、油酸乙酯、亚油酸乙酯的加标回收率、检出限、定量限 Table 2 The spike recoveries, limits of detection (LODs) and limits of quantification (LOQs) of ethyl palmitate, ethyl oleate and ethyl linoleate

分别准确量取一定量棕榈酸乙酯、油酸乙酯、亚油酸乙酯标准品, 加入到一定量空白乙醇中。加入10μ L内标液, 进样。每份样品重复进样5次, 对进样结果取平均值, 根据理论浓度及实际回收浓度平均值计算加标回收率。结果见表2。由表2可知, 3种酯类回收率均在90 %~110 %之间, 说明本方法的测定结果有效。

2.3.3 日内精密度及日间精密度测定

分别准确量取棕榈酸乙酯、油酸乙酯、亚油酸乙酯标准品, 加入到一定量空白乙醇中, 每次进样检测前加入10µ L内标液。

在同一天内3个不同时间段检测同一批样品, 计算一天内3次检测目标物含量的相对标准偏差, 得到日内精密度。取同一批样品, 在一天当中同一时段进样检测, 持续进样5天。计算5天内目标物含量的相对标准偏差, 得到日间精密度。所得棕榈酸乙酯、油酸乙酯、亚油酸乙酯的日内精密度及日间精密度见表3。其中3种目标物质日内精密度小于5 %, 日间精密度小于10 %, 说明本结果真实有效。

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 棕榈酸乙酯、油酸乙酯、亚油酸乙酯的日内精密度及日间精密度 Table 3 The inter- and intra-day precision of ethyl palmitate, ethyl oleate and ethyl linoleate 日内精密度(%) 日间精密度(%) 棕榈酸乙酯 3.0 6.2 油酸乙酯 1.9 7.5 亚油酸乙酯 4.4 9.8

表3 棕榈酸乙酯、油酸乙酯、亚油酸乙酯的日内精密度及日间精密度 Table 3 The inter- and intra-day precision of ethyl palmitate, ethyl oleate and ethyl linoleate

2.3.4 案件实际应用一例

2015年3月, 内蒙古通辽公安机关送检某品牌疑似假冒白酒一批, 要求鉴定酒样真伪。该批酒样在送检前已经当地相关质检部门鉴定, 总酸、总酯等各指标均符合白酒的国家标准规定。经检验, 该批白酒外包装与真品检出差异, 初步认定该批次白酒为假冒, 为进一步验证鉴定结论, 同时考察建立的棕榈酸乙酯、油酸乙酯、亚油酸乙酯3种酯类定性定量分析方法在实际应用中的可靠性, 选取该品牌不同批次白酒真品共5瓶, 加标进样后得到总离子流色谱图见图7。另取未知真伪的该品牌白酒酒样共2瓶, 加标进样后得到总离子流色谱图见图8。

图 7

Fig.7

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	图 7 某品牌5种不同批次白酒真品总离子流色谱图Fig.7 The total ions chromatograms of five samples in different batches of genuine products of a brand’ s liquor

图 8

Fig.8

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	图 8 某品牌2种未知酒样总离子流色谱图Fig.8 The total ions chromatograms of two samples from an unknown liquor suspected to counterfeit that of the brand’ s as indicated in Fig.7

图7可知, 不同批次真品白酒中均发现棕榈酸乙酯、油酸乙酯、亚油酸乙酯色谱峰, 且图中杂峰少, 目标峰峰形整齐, 无拖尾。通过本文定量分析法计算, 该品牌进行实验的5个批次白酒真品的棕榈酸乙酯、油酸乙酯、亚油酸乙酯含量分别为7.2~9.2μ g/mL, 4.5~5.6μ g/mL, 6.2~8.0μ g/mL。

图8显示, 未知真伪白酒色谱图均与真品色谱图差别较大, 杂峰多, 且找不到明显的棕榈酸乙酯、油酸乙酯、亚油酸乙酯色谱峰, 说明该白酒酒样中棕榈酸乙酯、油酸乙酯、亚油酸乙酯含量极低。由此可以判断, 该批白酒的生产原料或工艺与该品牌真品存在显著差异, 故认为该批酒样均为假冒商品。上述检验结果支持鉴定结论, 说明本文建立的分析方法准确有效。