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张凯, 罗海峰, 胡秋实, 于莉, 林长青, 杨笑熳, 周蕾. 上转发光技术快速检测尿液中氯胺酮[J]. 刑事技术,2016,41(2): 103-106
ZHANG Kai, LUO Haifeng, HU Qiushi, YU Li, LIN Changqing, YANG Xiaoman, ZHOU Lei. Rapid Detection of Ketamine in Urine Based on Up-converting Phosphor Technology[J]. Forensic Science and Technology,2016,41(2): 103-106  
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上转发光技术快速检测尿液中氯胺酮
张凯1, 罗海峰2,5, 胡秋实3,4, 于莉2, 林长青2, 杨笑熳3, 周蕾4,*
1.天津市公安局禁毒总队,天津 300240
2.北京热景生物技术有限公司,北京 102600
3.中海智（北京）科技有限公司,北京100027
4.军事医学科学院微生物流行病研究所病原微生物生物安全国家重点实验室,北京 100071
5.宁夏大学,银川 750021
* 通讯作者： 周蕾,副研究员,博士。 E-mail:ammszhoulei@aliyun.com

作者简介： 张凯,医学硕士,研究方向为毒品检验鉴定。 E-mail:zhangkai30@sohu.com

摘要

目的 利用上转发光免疫层析技术（UPT-LF）建立一种可在现场快速定量检测尿液中氯胺酮（Ketamine, KET）的方法并对其进行系统评价。方法 利用竞争法免疫层析原理,以上转发光材料（UCP）作为生物示踪物,建立快速检测尿液中KET含量的上转发光免疫层析定量检测方法（KET-UPT-LF）,并通过专用的便携UPT生物传感器分析进而计算出氯胺酮浓度。通过系列浓度标准品检测评价其敏感性、精密性及线性响应。收集经LC-MS鉴定的现场尿液样本,同时进行KET-UPT-LF及胶体金的检测,一方面通过与胶体金定性检测结果的比较来评价KET-UPT-LF对于实际尿液样本中KET的定性检测能力,另一方面通过与LC-MS的定量检测结果比较来评价KET-UPT-LF定量检测性能。结果 通过对系列浓度标准品检测结果分析,KET-UPT-LF敏感性为93.75 ng/mL,线性范围为93.75~6 000 ng/mL（r =-0.99448,P<0.0005）。在现场样品检测评价中,同一样本的KET-UPT-LF和胶体金结果在定性分析,其结果是一致的。KET-UPT-LF与定量确证方法LC-MS的定量检测结果经t检验无显著差异。结论 本研究建立的氯胺酮上转发光免疫层析定量检测方法（KET-UPT-LF）,在满足胶体金等快筛试剂快速简便的基础上,进一步实现了现场快速定量检测,且用户友好性优于LC-MS等定量确证方法,为现场快速定量检测尿液中的毒品提供了技术保障。

关键词: 上转发光技术; 免疫层析; 氯胺酮; 快速定量检测; 尿液
中图分类号:DF795.1 文献标志码:A 文章编号:1008-3650(2016)02-0103-04 doi: 10.16467/j.1008-3650.2016.02.005
Rapid Detection of Ketamine in Urine Based on Up-converting Phosphor Technology
ZHANG Kai1, LUO Haifeng2,5, HU Qiushi3,4, YU Li2, LIN Changqing2, YANG Xiaoman3, ZHOU Lei4,*
1. Drug Control Police Corps of Tianjin Municipal Public Security Bureau, Tianjin 300240, China
2. Beijing Hotgen Biotech Co., Ltd., Beijing 102600, China
3. China Intellectech (Beijing) Corp., Beijing 100027, China
4. State Key Laboratory of Bio-safety for Pathogenic microbes, Institute of Microbial Epidemiology,Academy of Military Medical Sciences, Beijing 100071, China
5. Ningxia University, Yinchuan 750021, China
Abstract

Objective To develop and evaluate an up-converting-phosphor-technology-based lateral flow (UPT-LF) assay for fast quantitative detection of Ketamine (KET) in urine.Methods KET-UPT-LF was established with the up-converting phosphor (UCP) nano-particles as the bio-label of competitive-mode-based LF assay. The results were analyzed by a specific portable UPT-based biosensor with which the concentration of ketamine was measured. The detectivity, precision and linearity were evaluated by testing the samples with serial standard concentrations. The urine samples were used to assess the KET-UPT-LF’s both qualitative and quantitative detection performance with immune colloidal gold technique and LC-MS as the respective reference.Results According to the analysis of urine samples detection, the sensitivity of KET-UPT-LF was 93.75 ng/mL and linearity range was 93.75-6000 ng/mL (r = -0.99448,P< 0.0005). The performance of qualitative and quantitative detection could meet the requirements of the on-site rapid detection of KET in urine. There was no significant difference between KET-UPT-LF and immune colloidal gold technique for qualitative detection and neither for quantitative detection between KET-UPT-LF and LC-MS.Conclusion The method of KET-UPT-LF for urine test is not only as quick and easy as colloidal gold technique but also provides quantitative detection with a more user-friendly feature compared to LC-MS, offering an alternative to realize on-site rapid detection of KET in urine quantitatively.

Keyword: up-converting phosphor technology; lateral flow assay; ketamine; rapid detection; quantitative detection; urine

氯胺酮, 俗称“ K粉” , 其化学名为2-邻氯苯基- 2-甲氨基-环己酮, 是苯环己哌啶的衍生物, 属非麻醉性镇痛药类。由于其在大量滥用后, 会产生兴奋、快感、幻觉及暴力倾向, 具有极大的社会危害性, 因此公安部将其明确列为毒品范畴, 并且中国食品药品监督管理局也将其列入一类精神药品管理范畴。氯胺酮滥用方式以粉末鼻吸、香烟混合吸食以及饮品混用饮用为主, 涉及为数可观的青少年群体, 且滥用主要在娱乐场所。

目前主要采用色谱法、质谱法以及色谱-质谱联用等方法进行氯胺酮的定量[1, 2, 3, 4], 这些方法准确性和重复性都非常好, 但无法用于氯胺酮的现场检测, 因为这些方法的操作繁琐, 检测时间长, 成本高, 仪器昂贵。近年来, 胶体金免疫层析[5]、酶联免疫[6]等各种技术不断涌现, 可以满足现场大量样品的快速筛查, 但这些方法仅可实现快速定性或半定量检测, 尚不能实现现场快速全定量检测。

针对氯胺酮现场快速定量检测的需要, 本研究以上转发光纳米颗粒（Up-Converting Phosphor nanoparticles, UCP-NPs）[7, 8]作为生物示踪物, 结合免疫层析技术, 建立了尿液中氯胺酮定量检测的上转发光免疫层析技术（Up-converting phosphor technology based lateral flow, UPT-LF）[9], UCP是在某些晶体的晶格中掺杂部分稀土金属元素形成纳米级颗粒, 由于稀土元素的最外层电子层存在亚稳定状态, 该独特性使得UCP具有独一无二的上转换发光现象[10, 11], 这种独一无二的性质使KET-UPT-LF在UPT生物传感器[12]中检测时完全无背景干扰, 因而可以实现现场快速定量检测尿液中的氯胺酮含量。

1 实验材料
1.1 试剂与材料

硝酸纤维素膜、玻璃纤维购自美国Millipore公司, 吸水纸及粘性底衬购自美国GE公司。UCP纳米材料（NaYF4:Yb3+, Er3+, 粒径50 nm, 激发光980 nm, 发射光541.5 nm）由上海科炎光电科技有限公司制备。十二烷基磺酸钠（SDS）、聚乙二醇（PEG）、蔗糖及牛血清白蛋白（BSA）等生化试剂均购自美国Merck公司。氯胺酮（KET）单克隆抗体及其与BSA交联KET抗原(KET-BSA)购自杭州隆基生物技术有限公司。氯胺酮标准品购自中国食品药品检定研究院。检测的尿液样本来自天津市公安局禁毒总队提供的现场采集的涉嫌吸毒人员尿液。对照检测使用的KET检测胶体金试剂盒购自艾康生物技术(杭州)有限公司。

1.2 主要仪器

UPT生物传感器由军事医学科学院微生物流行病研究所与北京热景生物技术有限公司联合研制; 其他主要设备包括：喷膜机（BioDot Inc）, 5417R高速离心机（Eppendorf）, DHG-9245A烘干机（上海一恒科学仪器）, CM4000可编程切条机（BioDot公司）。

2 实验方法
2.1 试纸条研制

将5mL样品垫处理液（0.03 mol/L磷酸盐缓冲液, 含1 %BSA、0.01 %SDS）滴加到30 cm× 1.5 cm的吸水纸上, 于37 ℃电热恒温鼓风干燥箱烘干2 h备用。将UCP-NPs分别与抗KET单克隆抗体共价偶联[13], 得到的UCP-抗KET单克隆抗体结合物与结合物稀释液以1:9比例混合, 将玻璃纤维浸泡于混合好的结合物稀释液中, 取出玻璃纤维, 在45 ℃下持续烘干45 min作为结合垫备用。以2 mg/mL KET-BSA与1 mg/mL羊抗鼠IgG分别按2μ L/cm喷于硝酸纤维素膜上作为检测带（T）与质控带（C）, 37 ℃下持续烘干1 h, 作为分析膜备用。将样品垫、结合垫、分析膜、吸水垫依次黏附于底衬上, 按4 mm/条斩切后, 置于塑料外壳中备用。

2.2 样品检测

直接取100μ L样品添加于试纸条上样孔, 静置层析15 min。用UPT生物传感器对试纸条进行信号的提取和分析, 获得检测带（T）与质控带（C）, 以T/C作为检测结果。样品中的KET与T带上的KET-BSA竞争结合UCP-抗KET单克隆抗体结合物, 未在T带上结合的UCP-抗KET单克隆抗体结合物会与C带上的羊抗鼠IgG结合, 从而形成样品中KET浓度与T/C值呈反比的量效关系。若待检样品T/C值小于KET阳性检测限1 000 ng/mL浓度所对应的T/C值（Cutoff值）, 则样品判定为阳性, 反之亦然。UPT生物传感器可通过已绘制好的标准曲线将T/C值换算出相应的样品中KET浓度值, 并可直接打印出结果。

2.3 敏感性、精密性及线性评价

以普通阴性尿液配制KET模拟阳性样品, KET系列浓度为0.0、93.75、187.5、375.0、750.0、1000.0、1500.0、3 000.0和6 000.0 ng/mL, 0.0 ng/mL重复检测10次, 其余每个浓度样品重复检测3次, 以0.0 ng/mL标准品作为空白对照, 以其T/C值的均值- 3倍标准差（x- -3SD）作为本底, T/C值低于本底所对应的最小浓度即为该方法的敏感性; 每个浓度的标准偏差（SD）除以平均值即为变异系数（CV）; 以Log (T/C)作为横坐标（x）, Log(浓度[ng/mL])作为纵坐标（y）, 绘制出定量标准曲线, 经统计拟合分析求得线性关系（见图1）。

2.4 现场检测评价

由天津市公安局禁毒总队提供现场采集涉嫌滥用氯胺酮人员的尿液30份, 经LC-MS确证, 其中23份为氯胺酮阳性, 7份为氯胺酮阴性。100μ L尿液直接上样到试纸条加样孔进行KET-UPT-LF检测, T/C值小于cutoff值为阳性, 反之即为阴性; 同时将尿样样品上样于胶体金试纸条检测（见表1）。用已知的LC-MS检测结果作为金标准, 对两种方法的定性检测结果进行分析, 评价KET-UPT-LF对现场尿样中氯胺酮的定性检测能力。将KET-UPT-LF的定量检测结果与LC-MS的检测结果进行配对T检验, 对两种检测方法定量结果准确性进行比较, 评价KET-UPT-LF对尿液中氯胺酮的定量检测性能。

3 结果与讨论
3.1 敏感性、精密性及线性评价

敏感性和精密性如图1a所示, 横坐标（x）为氯胺酮浓度（ng/mL）, 纵坐标（y）为T/C值, 以阴性样品的T/C值- 3SD作为本底, 可知KET检测敏感性为93.75 ng/mL; 图中百分比代表各浓度重复测量变异系数即精密性, 可知每个浓度重复测量的精密性均小于15 %。标准定量曲线如图1b所示, 图中横坐标（x）为Log(T/C), 纵坐标（y）为Log(浓度：ng/mL), 经统计拟合分析可知, KET-UPT-LF对KET进行检测在93.75~6 000 ng/mL范围内KET浓度与T/C值之间的具有线性关系（r = -0.99448, P< 0.0005）。

图 1 定量敏感性、精密性、线性评价Fig.1 Evaluation of sensitivity, accuracy and linearity

3.2 现场检测评价

将现场尿液样品分别用KET-UPT-LF和胶体金试纸进行定性检测（见表1）。

表1 现场尿液样品检测结果 Table 1 Detection results of on-site urine samples

以LC-MS检测结果作为金标准判定样品阴性或阳性, 分析KET-UPT-LF与胶体金的定性检测结果（见表2）。

KET-UPT-LF与胶体金对于尿液中KET的定性检测结果一致, 均未出现假阳性及假阴性结果, 定性检测性能较优。

将表1中KET-UPT-LF的定量检测结果与LC-MS的检测结果进行配对t检验, t=0.995, P=0.328> 0.05; 表明KET-UPT-LF与标准确证方法LC-MS的定量检测结果无显著性差异, 其定量检测性能较优。

表2 KET-UPT-LF与胶体金定性检测评价 Table 2 Comparison between KET-UPT-LF and colloid-gold LF kit
4 结 论

本研究首次用上转发光免疫层析方法实现了现场快速定量检测尿液中氯胺酮含量。在毒品或者其他小分子鉴定方面GC-MS是目前公认的准确方法[14], 通过与确证方法LC-MS方法进行比较, 结果表明, 该方法具有较好的精密度、敏感性和线性, 其定性定量能力与确证方法LC-MS无显著差异。整套设备携带方便, 检测快速, 可在20 min内完成整个现场检测。本方法中数据的提取和分析均通过UPT生物传感器完成, 结果客观准确, 可直接打印结果报告。与目前应用较多而只能定性或半定量的胶体金氯胺酮尿液检测试纸相比优势明显, 可更好的服务于公安禁毒部门, 其客观准确的定量结果将极大增加执法人员的信心。

The authors have declared that no competing interests exist.

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