引用本文
凃政, 石屹, 张广峰, 李万水. 一种焚烧骨骼的DNA提取方法[J]. 刑事技术,2016,41(1): 77-79
TU Zheng, SHI Yi, ZHANG Guangfeng, LI Wanshui. A New DNA Extraction Method for Burned Bones[J]. Forensic Science and Technology,2016,41(1): 77-79  
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《刑事技术》编辑部
一种焚烧骨骼的DNA提取方法
凃政, 石屹, 张广峰, 李万水
公安部物证鉴定中心,北京 100038

作者简介： 凃 政,主任法医师,学士,研究方向为法医遗传学。 E-mail: tudou0426@sina.com

摘要

本文介绍了一种针对烧骨的DNA有效提取方法。对烧骨进行研磨制成骨粉,对骨粉进行大体系脱钙和裂解, 采用Amicon® Ultra-15 离心过滤器对获得的脱钙、裂解上清液进行浓缩,提高DNA的回收率,使用硅胶膜法对浓缩后的DNA溶液进行纯化,并经复合STR扩增检验。使用上述方法成功完成两起严重焚烧骨骼案件的检验,确定了受害人身源。

关键词: 法医遗传学; 烧骨; DNA提取; 纯化; 短串联重复序列
中图分类号:DF795.2 文献标志码:B 文章编号:1008-3650(2016)01-0077-03 doi: 10.16467/j.1008-3650.2016.01.017
A New DNA Extraction Method for Burned Bones
TU Zheng, SHI Yi, ZHANG Guangfeng, LI Wanshui
Institute of Forensic Sciences,Ministry of Public Security,Beijing 100038,China
Abstract

This paper introduces a new DNA extraction approach for burned skeletal remains. The burned bones were grinded into powder, and then decalcified and digested in a large volume. Amicon® Ultra-15 centrifugal filter device was adopted to concentrate the supernatant after decalcification and digestion in order to increase the DNA recovery efficiency. Then the concentrated DNA supernatant was purified using silica gel membrane method. Autosomal STR genotyping was performed with commercial STR typing kits. Using this method, we have successfully identified the severely burned bones in two real cases, providing the key evidences for solving these cases.

Keyword: forensic genetics; burned bone; DNA extraction; purification; short tandem repeat（STR)

骨骼的STR检验是当前鉴定未知名尸骸身份的一种有效手段。但是在实际办案中经常会遇到焚尸的案件, 犯罪分子往往会通过焚烧尸体来达到毁尸灭迹的目的, 此类案件中死者尸体的软骨等软组织已经完全消失, 骨骼开裂碎片化, 骨骼内的DNA经过高温燃烧, 破坏降解十分严重, DNA含量大大降低, 难以进行检验。本文介绍了一种烧骨的DNA提取方法, 并已在个案中得到成功的应用。

1 试剂与方法
1.1 试剂、仪器

脱钙液0.5 mol/L EDTA pH 8. 0（Promega, 美国）, 蛋白酶K溶液（20 mg/mL）, DTT溶液 （1 mol/L）, 骨骼裂解液（Promega, 美国）, QIAquick® PCR纯化试剂盒（Qiagen, 德国）, PowerPlex® 21扩增试剂盒（Promega, 美国）, Identifiler® Plus扩增试剂盒（Thermo Fisher, 美国）。Amicon® Ultra-15 10K离心过滤器（Millipore, 德国）, SPEX 6770冷冻研磨机（SPEX SamplePrep, 美国）。

1.2 方法

提取方法参考文献[1, 2], 并在其基础上进行改进。

样品预处理 挑选焚烧程度相对较轻、厚度较厚的骨骼, 用手术刀去除烧骨表面层和污垢, 用纯水冲洗干净, 在 5% ( W/V) 次氯酸钠溶液中浸泡15 min, 纯水洗涤3 次后依次用无水乙醇、乙醚各浸泡 10 min, 于通风橱中干燥用干净滤纸包裹后砸成骨粉或用研磨机研磨成粉。

DNA提取 取适量骨粉（一般取2~5 g）, 置于50 mL 离心管中, 加脱钙液15 mL和蛋白酶K溶液100 μ L, 振荡混匀后置于摇床上脱钙12 h, 离心更换脱钙液和蛋白酶K溶液, 再脱钙一次。将离心收集的所有脱钙上清液置于一新的50 mL 离心管中。向收集的脱钙上清液中分别加入1 mL骨骼裂解液、50μ L DTT溶液以及200 μ L蛋白酶K溶液, 于56℃水浴消化过夜; 向已脱钙的骨粉中加入500 μ L骨骼裂解液、20 μ L DTT溶液以及50 μ L蛋白酶K溶液, 于56℃水浴消化12 h, 再按前量补加蛋白酶K、DTT, 消化2 h以上, 期间振荡3~5次。5000 g离心5 min后取上清液, 将两种上清液合并, 并加入等体积的氯仿/异戊醇（24∶ 1）进行有机法抽提, 5000 g离心5 min, 吸取上层水相采用Amicon® Ultra-15过滤柱4000 g离心浓缩。从Amicon® Ultra-15过滤柱浓缩后的液体置于1.5 mL 离心管中, 加入等体积的AL缓冲液, 震荡混匀, 70℃孵育10 min后13000 rpm离心3 min, 吸取上清液至新离心管中。之后使用QIAquick® PCR纯化试剂盒纯化：将PB缓冲液与所得的上清液按体积比2∶ 1混匀, 加入到纯化柱中, 8000 g离心30 s, 弃去滤过液。重复上述步骤直至液体全部过完纯化柱。向纯化柱中加入700 μ L PE 洗涤液, 于12000 g离心1 min, 弃去滤过液, 重复洗涤一次。12000 g空离2 min, 以甩干纯化柱中残余液体。将纯化柱置于新的1.5 mL离心管上, 加入30 μ L 65℃预热的EB 溶液至纯化柱的中心, 65℃孵育5 min, 12000 g离心2 min, 收集下层液体用于PCR反应或置于4℃保存备用。

PCR及电泳检测 使用PowerPlex® 21及Identifi-ler® Plus复合荧光试剂盒进行扩增, 10 μ L体系, 模板采用最大可加入量, 循环数30个。扩增产物经AB公司3500XL遗传分析仪进行检测, GeneMapper ID软件进行STR分型, 荧光峰的RFU值设定为≥ 50。操作按照相关试剂和仪器说明书进行。

2 案例资料

案例1 2008年12月, 出租车司机高某失踪。2009年1月, 办案单位在黄河南岸找到可疑焚烧残留物, 其中有三块疑似骨骼（见图1左）, 需鉴定骨骼是否来自高某。经法医和电镜检验, 骨骼均已碳化, 外观呈黑色, 三块骨骼被焚烧程度一致, 均可见骨外板、骨内板和板障, 最大骨块为4.2 cm × 3.8 cm, 电镜检见典型的哈氏系统, 确认烧骨为人骨。取其中一块骨骼按上述方法进行DNA检验, 其STR分型结果见图1右, 经与亲属样本比对, 死者确系高某。

图 1 现场提取的烧骨图（左）死者高某的烧骨STR分型图谱（右）Fig.1 Burned bones from scene (left) and STR profiling of the burned bones (right)

案例2 2014年2月, 胡某（2岁）在回家途中被打死。犯罪嫌疑人购买铁锅和汽油将尸体反复焚烧后抛弃。在诉讼中因“ 没有查到尸源, 不予案件受理” 。办案机关将现场收集到的烧骨碎片（见图2左）送至本实验室检验。取部分焚烧程度较轻的烧骨片按前述方法进行DNA检验, STR分型结果见图2右, 经与亲属样本比对, 死者确系胡某。

图 2 现场提取的骨骼碎片（左） 和死者胡某的烧骨碎片STR分型结果（右）Fig.2 The skeleton fragments from scene (left) and STR profiling of the victim’ s burned bone fragments (right)

3 讨 论

骨骼由骨细胞、纤维和基质三种成分组成, 有大量的钙盐沉积于细胞间质, 其无机盐成分占骨干重的65%~75%, 以羟基磷灰石形式[Ca10（PO4)6 (OH) 2]存在。骨骼DNA提取可利用EDTA的脱钙作用软化骨组织, 结合蛋白酶K和表面活性剂对细胞进行裂解, 释放深层骨组织中的DNA。骨骼脱钙后DNA检测结果明显优于未脱钙结果, 表明脱钙有助于细胞间的分散, 使骨粉变得粘稠细腻, 能够被裂解液充分消化[3]。由于DNA是水溶性的大分子, 单独的脱钙步骤会因弃去脱钙液导致DNA损失, 有研究[4]表明遗弃的脱钙液中含有大量DNA, DNA 损失高达50%以上。本方法收集所有脱钙液和裂解液, 多次采用消化、离心、吸取上清液等步骤减少滞留在骨粉中无法吸出的DNA, 尽量获得所有释放出的DNA分子进行纯化, 再使用Amicon® Ultra-15 10K离心过滤器去除大量水和小分子, 浓缩大分子DNA。此方法已在实际案件烧骨检材中得到有效的应用, 还可借鉴到诸如尿液、洗手液等大体系液体的DNA提取中。

徐国昌等[5]对成人股骨在不同温度及时间条件下焚烧后DNA的存留状况进行了研究, 伴随温度升高和时间延长, 检出的基因座数目逐渐减少, 燃烧温度在400℃的烧骨样本能扩增出100 bp左右的AMEL等基因座。由于STR 基因座片断长度的不同, 不同基因座抗降解能力有所不同, 其检出率存在差异, 片段长度短的基因座抗焚烧能力强, 因此使用片段更短的miniSTRs、SNPs、InDels等遗传标记有助于获得更多的DNA信息。在对烧骨STR检验中, 往往出现因降解导致的等位基因座间不平衡（见图1）和等位基因座丢失的现象, 为保证获得结果的可靠性, 建议除采用miniSTR扩增外, 还应综合使用增加DNA模板用量、多次平行扩增等方法对等位基因进行确认。

骨骼表面颜色可以反映出焚烧时的温度, 因受热顺序和时间差异, 同一骨骼表面色泽由黄色-褐色-深褐色-黑色-灰白色-白色依次进行变化[6]。一般条件下, 100~200℃骨骼表面呈褐色, 250~350℃骨骼表面呈深褐色、黑色, 400~450℃骨骼表面呈灰白色, 700℃以上呈白色[7]。文献[8, 9]研究表明, 有机质的燃烧一直持续到400℃, 无机质的重新构建开始于600℃, 并显示不同的形状; 1000℃无机质烧结在一起并持续到1400℃, 1600℃无机质熔化。随着焚烧温度的升高, 骨细胞逐渐失去原有的多边形、不规则形, 皱缩为圆形、卵圆形, 直至消失; 细胞数量逐渐减少, 400℃仅见少量细胞残骸, 600℃~1000℃观察不到细胞结构。通过对成人股骨进行干预性研究[5, 6, 7, 8, 9, 10], 表明500℃以上的焚烧骨骼已很难获得可比对的STR分型结果。因此骨骼表面呈现黄色、褐色表明DNA检验成功率较高, 呈现黑色表明可能还有有机质的存在, 白色表明烧骨基本由无机质构成, 这可以为烧骨检材选取和样品预处理方法提供参考依据。当然, 骨骼表面颜色只能作为一种参考, 在实践中还要综合考虑焚烧时间、保存时间、湿度、微生物、pH值、助燃剂、焚烧方法等因素对烧骨DNA检验的影响。

对焚烧尸骸的鉴定还要注意其它技术的综合使用。案例1中, 通过电子显微镜技术观察骨骼细微结构而判断烧骨碎块为人骨, 进行了种属的推断。此外, 法医学对骨骼损伤的分析、法医齿科学、死者体内或佩戴的金属等不易燃烧物品等都可为焚烧尸骸的身源推断提供依据。目前DNA技术在烧骨的个体识别中因DNA损伤、降解、量微等不利因素影响, 其应用还受到较大限制。随着DNA修复、全基因组扩增、单分子扩增、单分子测序等技术的发展, DNA技术在烧骨的个体识别中将会发挥更大的作用。

参考文献
[1] YE J, JI AQ, Esteban J, et al. A simple and efficient method for extracting DNA from old and burned bone. J Forensic Sci, 2004, 49: 754-759. [本文引用:1]
[2] 凃政, 刘志芳, 陈松, 等. 牙齿的DNA提取及STR分型研究. 刑事技术, 2007(5): 9-10. [本文引用:1]
[3] Cynthia R, Ayda LM, Emilio JY, et al. Comparison of two methods in isolating DNA from human skeleton for STR analysis. J Forensic Sci, 2012, 57(3): 706-712. [本文引用:1]
[4] 李花, 凃政, 石屹, 等. 骨骼脱钙后DNA含量损失问题初探. 中国法医学杂志, 2014, 29(2): 141-144. [本文引用:1]
[5] 徐国昌, 侯续伟, 任甫, 等. 不同温度焚烧对成人股骨16个基因位点的影响. 解剖学杂志, 2008, 31(3): 406-408. [本文引用:2]
[6] Thompson TJ. Recent advances in the study of burned bone and their implications for forensic anthropology. J Forensic Sci Int, 2004, 146(l): 203-205. [本文引用:2]
[7] 张继宗, 王北瑜. 炭化尸体的法医学鉴定. 刑事技术, 2000(2): 36-37. [本文引用:2]
[8] Holden JL, Phakey PP, Clement JG. Scanning electron microscope observations of heat-treated human bone. J Forensic Sci Int, 1995, 74(2): 29-45. [本文引用:2]
[9] 徐国昌, 张培华, 任甫, 等. 基于光学、电子显微镜图像的烧骨组织学变化特征. 解剖学杂志, 2012, 35(3): 380-383. [本文引用:2]
[10] 刘海东, 任甫, 席焕久, 等. 个体识别中烧骨的DNA提取. 解剖学杂志, 2010, 33(1): 119-121. [本文引用:1]