1200HPLC（Agilent, 美国）, MS-105DU（Mettler, 瑞士）, 钩吻碱甲标准品（含量≥ 99%）, 钩吻素子标准品（含量≥ 99%）。乙腈为色谱纯（Merck, 德国）, 去离子水（密理博）; 其余均为分析纯。

色谱柱：Welchrom C18（250 mm× 4.6 mm, 5 µ m）; 流动相：乙腈（A）-0.025％三乙胺水溶液（B）, 梯度洗脱（0 min, 0.5%A; 5 min, 1%A; 10 min, 3%A; 15 min, 8%A; 20 min, 15%A; 40 min, 30%A; 46 min, 36%A; 60 min, 65%A）, 流速：1 mL/min; 柱温：30 ℃; 检测波长：272 nm。

样本：采集9批不同来源的钩吻植物样本（见表1）, 经鉴定为马钱科（Loganiaceae）植物断肠草（Gelsemium elegans Benth）(胡蔓藤)的全株植物。混合对照品溶液制备：取钩吻碱甲4.721 mg, 钩吻素子5.383 mg, 置10 mL容量瓶中, 加甲醇溶解定容至刻度, 摇匀, 即得。供试品溶液制备: 水煎煮供试品溶液的制备方法如下：取钩吻药材（过60目筛）约1 g, 精密称定, 置烧杯中, 精密加入45 mL水, 称定重量, 煎煮2 h, 冷却至室温, 再称定重量, 用水补足减失的重量, 摇匀过滤, 再过0.45 μ m的微孔滤膜, 即得。

表 1

Table 1

表 1(Table 1)

表 1 钩吻植物采集信息表 Table 1 Collection information of gelsemium plant 编号 药材产地 收集时间 收集方式 1 广西玉林 2013.08 采收 2 广西河池 2013.08 采收 3 广西玉林 2013.08 购买 4 湖北武汉 2013.09 购买 5 浙江杭州 2013.07 购买 6 福建福州 2013.10 采收 7 贵州兴义 2013.08 采收 8 贵州凯里 2013.08 采收 9 贵州都匀 2013.08 采收

表 1 钩吻植物采集信息表 Table 1 Collection information of gelsemium plant

精密吸取10µ L供试品溶液, 按“ 1.2” 项下条件连续测定6次, 记录色谱图。以钩吻素子为参照峰, 考察共有峰相对保留时间（RRT）和相对峰面积（RPA）的一致性, 结果RSD均小于1.9%, 精密度试验相关系数R均大于0.9, 符合要求。

按照“ 1.3” 项下方法制备供试品溶液（n=6）, 照“ 1.2” 项下条件测定。以钩吻素子为参照峰, 考察共有峰RRT、RPA的一致性, 结果RSD均小于3%, 重复性试验相关系数R均大于0.9, 结果表明重复性良好, 符合要求。

取供试品溶液, 按照“ 1.2” 项下条件在0、2、4、8、12、16、24h7个不同的时间点进样测定。以钩吻素子为参照峰, 考察共有峰的RRT、RPA稳定性, 结果RSD均小于3%, 稳定性试验相关系数R均大于0.9, 结果表明溶液24 h内稳定性良好。

采用药典中《指纹图谱评价系统》, 9批样本匹配图结果如图1所示, 相似度结果见表2。结果显示, 1、2、3、4和8号钩吻药材相似度大于0.9, 5和6号钩吻药材相似度大于0.9, 7号、9号钩吻药材与其他产地药材相似度均较低。

图 1

Fig.1

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	图 1 9批样本指纹图谱重叠图。S1：广西玉林; S2：广西河池; S3：广西玉林; S4：湖北武汉; S5：浙江杭州; S6：福建福州; S7：贵州兴义; S8：贵州凯里; S9：贵州都匀; R：共有模式。Fig.1 HPLC fingerprints of 9 batches of plant samples. S1: Yulin, Guangxi; S2: Hechi, Guangxi; S3: Yulin, Guangxi; S4: Wuhan, Hubei; S5: Hangzhou, Zhejiang; S6: Fuzhou, Fujian; S7: Xingyi, Guizhou; S8: Kaili, Guizhou; S9: Duyun, Guizhou; R: common mode.

表 2

Table 2

表 2(Table 2)

表 2 9批样本的相似度结果 Table 2 The similarity analysis of 9 batches of plant samples S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 R S1 1.000 0.958 0.938 0.935 0.367 0.343 0.461 0.903 0.160 0.893 S2 0.958 1.000 0.971 0.970 0.243 0.220 0.397 0.936 0.126 0.881 S3 0.938 0.971 1.000 0.984 0.271 0.251 0.425 0.969 0.145 0.904 S4 0.935 0.970 0.984 1.000 0.300 0.275 0.426 0.947 0.172 0.920 S5 0.367 0.243 0.271 0.300 1.000 0.991 0.728 0.253 0.180 0.432 S6 0.343 0.220 0.251 0.275 0.991 1.000 0.718 0.235 0.198 0.399 S7 0.461 0.397 0.425 0.426 0.728 0.718 1.000 0.514 0.167 0.473 S8 0.903 0.936 0.969 0.947 0.253 0.235 0.514 1.000 0.146 0.863 S9 0.160 0.126 0.145 0.172 0.180 0.198 0.167 0.146 1.000 0.255 R 0.893 0.881 0.904 0.920 0.432 0.399 0.473 0.863 0.255 1.000

表 2 9批样本的相似度结果 Table 2 The similarity analysis of 9 batches of plant samples

研究中, 以主成分峰面积为变量, 研究钩吻的聚类情况, 主成分分析的结果如图2左所示。7号、9号远离其它钩吻药材, 说明二者的化学成分与其它药材有很大不同, 这与上述相似度分析结果相近。从图1峰面积比较中可看出, 7号样品特征峰中除1号色谱峰外, 其余色谱峰峰面积均较其他样品峰面积小, 且由图1可知, 7号样品在18~25 min时间段出现了一些特有的色谱峰。同样, 9号样品1~3号色谱峰峰面积与其他样品相差不多, 4~8号色谱峰峰面积均较其他样品的小, 所以7号和9号样品与其他样品有明显差别, 且7号和9号差异也较大。其他样品又可大致分为三类：1、2号样品距离近; 3、4、5号样品距离近; 6、8号样品距离接近。

图 2

Fig.2

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	图 2 9批钩吻药材主成分分析结果（左）和聚类分析树状图（右）Fig.2 Principal component analysis of 9 batches of plant samples (left) and their cluster analysis tree (right)

SPSS数理统计软件对9批钩吻样本进行聚类分析, 以样本的共有峰面积为主要特征, 用离差平方和法, 按欧氏距离对样品进行聚类分析（见图2右）。结果显示, 9批不同产地的钩吻药材成分大致可分为四类：5和6为一类, 7号、9号各为一类, 其余样品为一类。由聚类分析结果可知：不同产地来源的钩吻其内在化学成分均有差异, 因此呈现出不同的分类, 可用于案件中毒物不同产地来源类别分析。

试验考察在200~400 nm范围内进行全波长扫描, 结果在272 nm下, 色谱图基线平稳, 色谱信息丰富, 且各色谱峰峰面积较大; 甲醇-水、乙腈-水和乙腈- 0.025%三乙胺水溶液3种流动相系统相比较, 乙腈-水系统得到的色谱图色谱峰形、数目优于甲醇-水系统, 且主要成分是生物碱^{[6, 7, 8]}, 故在水相中加入适量三乙胺调节, 结果显示, 峰形有明显的改善, 最终选择乙腈- 0.025%三乙胺系统作为流动相洗脱系统; 试验比较了25℃、30℃、35℃、40 ℃的色谱图, 结果表明当柱温为30 ℃时, 所得色谱峰峰形对称性、峰分离度均较好, 且基线平稳; 通过反复调整乙腈和0.025%三乙胺水溶液的洗脱比例, 最终洗脱程序如“ 1.2” 项下所示, 该条件下各共有峰均能与相邻峰达到基线分离, 且峰形对称, 出峰时间适中。试验分别使用Diamonsil C18、Agilent C18、Welchrom C18（规格均为4.6 × 250 mm, 5 μ m）三种不同的色谱柱进样, 结果表明采用Welchrom C18柱所得到的色谱信息丰富, 各峰的保留值适宜, 分离度、峰形及柱效较好, 故选择Welchrom C18柱进行测定。

聚类分析目标是在相似的基础上收集数据来分类, 与普通分类不同在于要求划分的类是未知的, 本次研究样本真实情况未知, 应采用此法进行数据分析, 研究结果可知, 不同产地的钩吻其内在化学成分均有差异, 因此呈现出不同的分类。分类结果与主成分分析分类结果相似, 即7号、9号药材各自为一类。这是由于7号、9号样本多数峰峰面积较其他样品峰面积小, 而7号药材在18~25 min时间段有一些特有的色谱峰, 故有上述分类结果。但通过聚类分析和通过主成分分析所得分类结果也存在一定差异, 主成分分析8号样品距离1~6号较远, 而聚类分析中8号样品却和1~4号归为了一类, 这提示对实际样本的来源判断应综合考虑主成分和峰面积因素, 尤其是在混合样本中对杂峰分离问题对测定的影响, 或考虑采用专属性更高的检测器。

根据“ 2.5” 项下对不同产地来源钩吻的主要成分及聚类分析结果显示, 同省份（如贵州）钩吻在主成分方面就有着较大差异, 大致相同的气候不同的地貌可能是影响其主要成分形成的因素, 而不同省份样本（湖北与浙江）却在主成分分析中基本一致, 虽然植物每年在生长过程中一定程度上会受环境变化影响, 但是其主要成分变化相对恒定, 可以作为初步判断毒物来源的聚类分析依据, 如能准确定位差异性、指标性成分, 且对吸收入血后的移行成分进行筛查, 更能对毒物进入体内前的产地来源判断提供依据, 从而对实际法医毒理学工作提供帮助。

由于试验对象非规模化种植或生产植物, 仅收集到5个省份9批次样本, 未达到中药指纹图谱对批次的要求, 测定数据由此应会出现一些“ 极端” 情况, 采取中位数法计算相似度, 以扣除偏大或偏小数据的影响, 同时在“ 共性” 之外对数据“ 差异” 的个体甄别达到来源区分才是试验最终目的。