对严重降解的检材进行STR分型时, 可形成Ladder-like条带｡Ivanov等^[1]在对车臣战争中死亡士兵的遗骸进行检测时, 发现许多样本的STR分型出现Ladder-like条带｡通过碱处理人K562细胞株, 人为控制DNA降解程度, 当DNA长度降至160 bp以下时, 即出现Ladder-like条带干扰｡

Ivanov等^[1]在对遗骸中降解程度重的肌肉分型时, 发现vWA基因座主带下方出现几条较弱的次带, 而降解程度轻的牙齿和干皮没有出现Stutter带, 提示检材DNA的降解程度和出现Stutter带的机率成正相关｡目前对于降解检材中易出现Stutter带的原因, 尚不清楚｡

降解检材进行STR分型时, 含有杂合子的基因座易出现等位基因扩增不平衡, 甚至等位基因丢失, 致使将杂合子误判为纯合子｡其原因可能为降解检材中, 两等位基因拷贝数不同, 导致各等位基因扩增效率差别｡加之不同产物变性和退火温度不同, 不平衡扩增现象将更为明显^[2]｡

降解DNA在PCR延伸阶段容易造成碱基掺入错误｡掺入错误的原因与聚合酶特性､降解检材碱基改变有关｡Taq聚合酶错误掺入率在2× 10⁴左右, 然而在改变扩增条件及模板序列的条件下, 其错误率可以提升10倍以上^[3]｡PCR早期循环的编码错误会在后期循环中被放大, 导致DNA序列错误｡使用高保真聚合酶可以减少此类现象的发生｡此外, DNA的水解反应能将胞嘧啶､5-甲基胞嘧啶､腺嘌呤､鸟嘌呤､分别转变为尿嘧啶､胸腺嘧啶､次黄嘌呤､黄嘌呤, 导致PCR编码错误｡由于PCR-STRs是基于DNA片段长度进行分型, 故PCR编码错误对结果的影响不大^[3]｡

在降解DNA中, 由于小片断DNA过多, 而大片段相对较少, 扩增时小片段DNA被优势扩增, 导致大片段分型失败^[8]｡因此, 如何提高大片段在模板DNA中的比例就成为关注的焦点^{[9, 10]}｡Wang等^[9]利用磁珠杂交技术, 设计仅与含大片段STR的DNA片段结合的探针, 杂交后与磁珠结合, 洗去未结合的DNA片段及其它成分, 回收后的DNA经复合扩增体系检测, 大片段STR基因座得以成功分型｡

对损伤DNA进行修复以提高分型成功率的研究日益受到关注｡Pusch等^[11]尝试运用大肠杆菌DNA聚合酶I和T4 DNA连接酶修复大约公元450~700年间的骨骼样本, 取得了较好的效果｡后来, Kovatsi等^[12]同样应用DNA聚合酶I和T4 DNA连接酶对公元前1700~2100年的10枚牙齿DNA进行修复, 成功从其中8枚扩增出性别基因｡Bonin等^{[13, 14]}利用Taq DNA聚合酶修复甲醛及Bouin氏液固定组织DNA, 然后扩增长度不同的基因座, 各基因座检出率较未修复DNA有不同程度提高｡本文作者利用Taq DNA聚合酶修复普通甲醛及中性甲醛固定组织DNA, 在修复过程中引入PCR循环参数, 使大量DNA短片段以长片段为模板, 经过模拟PCR循环, 得以放大性延伸, 复合STR扩增等位基因检出率较未修复DNA有较大提高｡双链断裂是降解检材DNA损伤的主要类型, DNA修复更为困难｡Battista^[15]应用RecA蛋白､单链结合蛋白和DNA聚合酶, 修复DNA双链断裂, 能使约40%的DNA重新连接, 为DNA修复提供了一种新的方法｡目前商业化的修复试剂主要有PreCR^TMRepair Mix和Restorase^® 等^[16]｡

短串联重复序列(short tandem repeat, STR)技术已经广泛应用于法医物证领域, 常用的STR分型商品化试剂盒扩增片段长度多为100~450 bp｡目前, 提高降解DNA检出率主要方法是缩短扩增片段长度, 如miniSTR､单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)､插入/缺失多态性(insertions/deletions, InDels)等｡与常规STR相比, miniSTR尽管灵敏度较高, 但受到扩增片段长度的限制, 在一个复合扩增体系中只能同时扩增较少数量的基因座｡此外, 因miniSTR需重新设计引物, 应注意其分型结果与传统STR分型的一致性｡SNP扩增产物通常小于100 bp, 更适合于降解DNA分型｡大多数SNPs仅有2个等位基因, 其鉴别能力有限, 而三等位基因SNPs的鉴别能力相对较高｡Westen等^[17]研究了31个三等位基因SNPs组成的复合扩增系统, 能有效检验降解DNA, 还能检出比例为8:1的混合检材｡核小体中组蛋白和DNA复合物能阻止DNA降解, 组蛋白和DNA复合物通常能保护147 bp的DNA序列^[18]｡Freire-Arada等^[19]筛选出靠近核小体中部的18个SNPs位点, 组成复合扩增体系, 其检测降解检材的灵敏度比普通SNPs复合体系高6%, 且明显高于miniSTRs｡Thanakiatkrai等^[20]对60个STR基因座分析后发现, 大多数STR 基因座的DNA序列都倾向于与核小体结合成一个整体, 能较好地抵抗外界损伤, 建议在选择遗传标记时尽量选择那些可以受到保护的基因座｡InDel作为一种特殊类型的二等位基因标记, 兼具SNP和STR的特征, 扩增产物大小灵活可变, 且能够兼容毛细管电泳平台, 是降解生物检材分型的另一个较好选择^[21]｡

线粒体DNA(mitochondrial DNA, mtDNA)因具有拷贝数多､环状结构抗腐败能力强的特点, 尤其适用于降解生物检材的DNA分型｡因此, 当常规STR､miniSTR､SNP等分型失败时, mtDNA检测不失为一个较好的选择｡但mtDNA为母系遗传, 其意义仅在于排除, 加之mtDNA具有异质性, 对结果的解释造成不利影响｡

全基因组扩增(whole genome amplification, WGA)是一种对全部基因组序列进行非选择性扩增的技术, 可在没有序列倾向性､高准确度的前提下大幅度增加DNA的总量, 并能以其扩增产物作为模板, 进行后续分析｡WGA技术已被众多研究者尝试应用于多种降解样本的检测｡Giardina等^[22]联合应用多重置换扩增(multiple displacement amplification, MDA)和SNPs检测人工降解DNA, 未经MDA步骤的降解DNA至少有4%位点分型失败, 而经MDA步骤的降解DNA全部分型成功｡Wang等^[23]介绍了一种称之为RCA-RCA(restriction and circularization-aided rolling circle amplification)的技术, 该技术能成功扩增福尔马林固定组织DNA, 使其放大数千倍, 且微卫星测试表明扩增后的DNA与原始DNA一致｡Maciejewska等^[24]系统比较了7种WGA方法, 降解检材及非降解检材经WGA扩增后, DNA产量最高的方法为RCA-RCA法, 最低为PEP-PCR(primer extension preamplification PCR)法｡STR分型方面, 非降解检材分型以GenomiPhi试剂盒和PEP-PCR法最好, 降解检材分型以GenomePlex试剂盒最好, 可以扩增长度为100 bp的片段｡值得注意的是, WGA技术联合STR检验常会出现等位基因不均衡扩增､等位基因丢失或插入､stutter峰等现象, 影响分型结果的判读｡

除了上述方法, 可以在电泳前对扩增后产物进行纯化, 以去除未结合的引物､dNTP､盐等成分, 增加PCR产物进入毛细管的数量｡Westen等^[25]应用下一代测序技术中的PCR片段筛选和纯化技术回收PCR后产物, 此技术通过调整PCR产物和磁珠的比例, 可回收不同大小的DNA片段｡通过纯化回收, 大片段产物峰高可增加3~4倍, 而小片段却不增加｡丰蕾等^[26]应用分子筛､超滤膜､亲和层析等方法纯化PCR后产物, 发现纯化PCR产物可以增强STR分型峰强度约4倍, 同时增加等位基因检出率｡但PCR产物纯化后不会改善杂合子峰高不平衡现象｡

许多学者对其他方法进行了尝试, 如巢式PCR(nest PCR)^[27]､寡核苷酸连接检测(oligonucleotide ligation assay, OLA)^[28]､直接多重测序(direct multiplex sequencing, DMPS)^[29]､基于连接酶反应的PCR(ligase detection reaction-PCR, LDR-PCR)^[30]等｡如Strom 等^[27]运用巢式PCR技术成功鉴别烧焦人体组织的性别｡Zhang等^[30]利用LDR-PCR方法, 准确得到片段长度小于100 bp的高度降解DNA SNPs基因座分型, 并可进行4个基因座复合分型检测｡