Prominence UFLC（日本岛津公司）, 配有LC-20AD XR型泵、SIL-20AC XR型进样器、SPD-20A型紫外检测器、CTO-20AC 型柱温箱、数据处理软件LC solution; 岛津ODS-SP型（150mm× 4.6mm, 5 μ m）色谱柱; EYELA型涡旋混合器; KQ3200型超声振荡器; 台式高速冷冻离心机（SIGMA公司, 德国）; 纯水仪（美国Millipore公司）。

JWH-250（1.0 mg/mL）、四氢大麻酚（Δ 9-tetrah-ydrocannabinol THC, 100 μ g/mL）标准品溶液（美国Cerilliant公司）, 大麻二酚（cannabidiol CBD, 1.0 mg/mL）对照品、大麻酚（cannabidnol CBN, 1.0 mg/mL）对照品（中国食品药品鉴定研究所）; 乙腈色谱纯试剂（美国Fisher Scientific公司）; 高纯水（经Millipore simplicity纯水系统制备）。

取1.0 mg/mL的JWH-250标准品溶液适量, 用甲醇稀释, 配制成质量浓度为0.1 mg/mL的标准储备液; 取0.1 mg/mL的标准储备液适量, 配制成质量浓度分别为0.05、0.02、0.01、0.005、0.002 mg/mL的系列标准工作液备用。

在干燥清洁的实验环境下, 对缴获的香料毒品进行充分研磨, 精密称取适量, 用20 mL甲醇定容, 超声脱气20min, 5000 r/min离心5 min, 再经0.45 μ m滤膜过滤, 滤液备用。

有机相初始浓度是指梯度洗脱程序开始时流动相中有机相占全部流动相的体积分数。本实验以乙腈-高纯水为流动相对检测物进行梯度洗脱^[5], 在梯度陡度为1%/min、柱温为35℃、流速为1 mL/min的色谱条件下, 考察有机相初始浓度（50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%）对各指标的影响。实验结果表明：有机相初始浓度自50%增加到80%的过程中, 保留时间随有机相初始浓度增加而减少, 从19.5 min降到了4.2 min; 峰面积受有机相初始浓度变化的影响不大; 峰高随有机相初始浓度增加而升高, 从39332增加到81356; 理论塔板数随有机相初始浓度增加而降低, 从41847下降到7679。根据上述结果, 暂定有机相初始浓度为63%。

在有机相初始浓度为63%、柱温为35℃、流速为1 mL/min的色谱条件下, 将梯度陡度设为0.5%/min、1.0%/min、1.5%/min、2.0%/min、2.5%/min、3.0%/min、3.5%/min、4.0%/min、4.5%/min进行实验, 考察梯度陡度对各指标的影响。实验结果表明：梯度陡度自0.5%/min增加到4.5%/min的过程中, 保留时间随梯度陡度增加而减少, 从9.7 min降到了7.5 min; 峰面积受梯度陡度变化的影响不大; 峰高随有机相初始浓度增加而升高, 从45808增加到85982; 理论塔板数随梯度陡度增加而升高, 从13706上升到26319。为保证较高的柱效和响应值, 将梯度陡度选定为4.2%/min。

在有机相初始浓度为63%、梯度陡度为4.2%/min、柱温为35℃的色谱条件下, 将流速设为0.8、0.9、1.0、1.1、1.2 mL/min进行实验, 考察流速对各指标的影响。实验结果表明：流速自0.8 mL/min增加到1.2 mL/min的过程中, 保留时间随流速增加而减少, 从9.7 min降到了6.9 min; 峰面积随流速的增加而减小, 从715302减小到478663; 峰高随流速的增加而降低, 从82436下降到65134; 理论塔板数随梯度陡度增加而降低, 从27524降低到19092。据此将流速设定为0.8 mL/min。

在有机相初始浓度为63%、梯度陡度为4.2%/min、流速为0.8 mL/min的色谱条件下, 将柱温设为30℃、32℃、34℃、36℃、38℃、40℃进行实验, 考察柱温对各指标的影响。实验结果表明：柱温自30℃增加到40℃的过程中, 保留时间随柱温增加整体趋势下降, 从5.640 min降至5.313 min; 但柱温自38℃升至40℃过程中, 保留时间从5.302 min略升至5.313 min; 峰面积基本保持不变; 峰高随柱温的升高而上升, 从68593增加到71772; 理论塔板数随柱温升高整体趋势下降。据此确定流速为34℃。

为实现对不同波长的考察, 本实验采用二极管阵列检测器（DAD）对JWH-250标准品溶液进行分析, 光谱图见图2。JWH-250在波长200 nm附近吸收强度达到最大值。对最佳检测波长的选择, 考虑以下两方面：（1）优选目标物质的较强吸收波长; （2）尽量避免流动相中本底的干扰。检测波长越低, 越容易受到流动相本底干扰, 基线随洗脱梯度变化幅度越大, 可能对峰形和峰面积都造成不利影响, 比如积分的漂移或者偏差等^[6], 这些因素都有可能影响最终的定量结果。因此, 最终确定最佳检测波长为214 nm。

图 2

Fig.2

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	图 2 JWH-250的光谱图Fig.2 Spectrogram of JWH-250

记录JWH-250标准溶液在预实验条件（检测波长为220 nm, 有机相浓度为70%、梯度陡度为1%/min, 柱温为35℃, 流速为1 mL/min）下的色谱行为, 并与有机相初始浓度为63%、梯度陡度为4.2%/min、流速为0.8 mL/min、柱温为34℃、检测波长为214 nm的色谱条件下的色谱行为进行对比, 考察实验方案的优化效果。

通过对比可知, 经优化, JWH-250的保留时间略有滞留, 由9.244 min升至9.678 min; 但峰面积、峰高、理论塔板数数值都有显著提升, 峰面积从574187升至637541, 峰高从53190升至84841, 理论塔板数从16662.038升至34787.312。因此, 本实验的优化方案效果良好、切实可行。

由于在实际缴获的合成大麻素毒品中可能含有天然大麻素的成份, 如大麻二酚（CBD）、大麻酚（CBN）和四氢大麻酚（THC）, 为了考察这三种天然大麻素成份对JWH-250是否存在干扰, 将JWH-250标准品与上述几种天然大麻素的标准品混合制成待测试样, 并用优化方法进行分析, 色谱图见图3。JWH-250与其他组分之间的分离度均大于2, 能够实现完全分离, 方法专属性良好。

图 3

Fig.3

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	图 3 混标试样色谱图Fig.3 Chromatogram of the mixed standard sample

精密吸取一定量0.1 mg/mL的JWH-250标准品溶液, 用甲醇逐级稀释, 配制成质量浓度0.05、0.02、0.01、0.005、0.002 mg/mL的系列标准工作液, 分别进样, 每份样品在相同条件下进样3次, 进样量均为10 μ L, 在有机相初始浓度为63%、梯度陡度为4.2%/min、流速为0.8mL/min、柱温为34℃的色谱条件下进行分析, 以JWH-250的质量浓度为横坐标（X）, 峰面积积分值为纵坐标（Y）建立线性回归方程：Y=36525020X-4291.956, R²=0.999 929 9, R=0.999 964 9。结果表明, JWH-250在检测浓度2~100 μ g/ml范围内线性良好, 相关系数为0.999 96。本实验以信噪比S/N(p/p)≥ 3确定检出限, 得到JWH-250的检出限为0.1μ g/mL。

取0.01 mg/mL的JWH-250标准品溶液, 在改善后的色谱条件下, 1日内分别进样6次, 计算日内相对标准偏差。连续6日, 每天平行进样2次, 取平均值Xn（n=1, 2, 3, 4, 5, 6）, 计算X₁~X₆的日间相对标准偏差。结果表明, JWH-250的日内相对标准偏差为0.64%, 日间相对标准偏差为1.72%, 精密度良好。

采用1.3样品处理方法, 在实验确定的优化色谱条件下对案件缴获的香料毒品样品进行检测分析, 考察目标检测物与其他组分的分离效果和抗干扰性, 评价优化方案的实际操作性。得到某一实际样本的色谱图见图4。经过与标准品比对, 色谱图中JWH-250峰, 能与其他物质清晰地分离。实际样本所得峰面积代入线性回归方程, 计算得实际样本中JWH-250的质量浓度c为0.01512 mg/mL; 将c=0.01512 mg/mL代入公式：样品中的目标物含量(纯度)% = 0.01512mg/mL× 稀释体积/样品重量× 100%, 最后可得JWH-250的含量为0.53%。

图 4

Fig.4

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	图 4 实际样本色谱图Fig.4 Chromatogram of a seized drug sample