GlobalFiler™试剂盒在尸骨鉴定中的应用
任文彦1, 郝宏蕾1, 王怀锋2, 吴微微1, 苏艳佳1
1. 浙江省公安物证鉴定中心,浙江省刑事科学技术应用研究重点实验室,杭州 310009
2. 浙江警察学院,杭州310053

作者简介: 任文彦(1984—),男,山西吕梁人,主检法医师,硕士,研究方向为法医遗传学。 E-mail: sxwenyan@sina.com

摘要

目的 分析GlobalFiler™试剂盒在白骨化尸体身源认定中的技术性能指标。方法 采用硅珠法提取50份尸源认定中的骨骼、牙齿样本DNA,其中三联体亲权鉴定11份,二联体亲权鉴定39份,比较GlobalFiler™试剂盒和Identifiler Plus试剂盒检验结果。结果 GlobalFiler™试剂盒成功检出了50份样本STR分型。11份三联体的尸源认定中,两种试剂盒计算得到的CPI值均能达到10 000以上,但GlobalFiler™试剂盒得到的累积父权指数(CPI值)更高,其中10份能达到108以上。39份二联体的尸源认定中,GlobalFiler™试剂盒得到的CPI均能达到10 000以上,而Identifiler Plus试剂盒得到的CPI值能达到10 000以上的只有30例。而且GlobalFiler™试剂盒扩增得到21个常染色体,Amel基因座和Y-indel、DYS391的分型信息,其特有的Y-indel和DYS391两个基因座,确保在Amelogenin基因座Y等位基因丢失的样本中,可以成功检出性别基因,防止性别误判。结论 GlobalFiler™试剂盒扩增可以获得比目前常用的Identifiler Plus试剂盒更多基因信息,大大提高了身源鉴定中的CPI值,而且可以有效避免Amelogenin基因座Y等位基因丢失时导致的无名尸体性别误判。因此,Globalfiler试剂盒在白骨化尸体身源认定中具有较高的应用价值。

关键词: 法医遗传学; STR基因座; Y等位基因缺失; GlobalFiler™试剂盒; 骨骼; 牙齿; 累积父权指数
中图分类号:DF795.2 文献标志码:B 文章编号:1008-3650(2015)04-0379-03 doi: 10.16467/j.1008-3650.2015.05.008
Identification of Unknown Corpses Using GlobalFiler™ Kit
REN Wenyan1, HAO Honglei1, WANG Huaifeng2, WU Weiwei1, SU Yanjia1
1.Zhejiang Key Laboratory of Forensic Science and Technology, Institute of Forensic Science of Zhejiang Provincial Public Security Bureau, Hangzhou 310009, China
2.Zhejiang Police College, Hangzhou 310053 , China
Abstract

Objective To analyze the performance of GlobalFiler™ kit testing bones of corpses. Methods Silicon bead method was used to extract DNA from 50 samples of bones and teeth that were all required to determine their source with 11 of them waiting for the triplet and the rest 39 ones the duo paternity testing. The GlobalFiler™ kit and Identifiler Plus kit were employed to evaluate their testing competence and cumulative paternity index (CPI) values. Results GlobalFiler™ kit successfully detected the STR types of the 50 samples. For identification of cadaveric source of the 11 triplet cases, although both kits showed to have CPI values greater than 10,000, the GlobalFiler™ kit performed even better with its CPI larger than 108 in 10 out of the 11 cases, much higher than that of Identifiler Plus kit. For the 39 duo cases, GlobalFiler™ kit again elevated its CPI≥10,000 while the Identifiler Plus kit was only 30. Furthermore, GlobalFiler™ kit can expose the genotyping of 21 autosome, Amelogenin, Y-indel and DYS391, especially with the last two exclusive loci for the kit to be capable of determining gender when samples are even of Y-allele-absence in Amelogenin. Conclusions GlobalFiler™ kit, capable of amplifying more loci in a single run of amplification than the widely used Identifiler Plus kit, has greatly increased the CPI for identifying unknown bodies. Moreover, its additional Y-chromosome loci can help determine gender more effectively. Therefore, GlobalFiler™ kit is high applicable in identifying unknown bodies.

Keyword: forensic genetics; STR loci; Y-allele absence; GlobalFiler™ kit; bone; teeth; cumulative paternity index (CPI)

在高度腐败以及白骨化尸体的尸源认定中, 骨骼牙齿由于其特殊的组织结构, 经常是此类案件中可用DNA检验的唯一生物检材。在检验过程中, 因其特殊性, 对PCR扩增系统的要求更高。本研究对GlobalFiler™ 试剂盒在骨骼牙齿等硬组织类样本DNA扩增中的效果应用进行了探讨, 并与目前常用的Identifiler Plus试剂盒进行比较, 报告如下。

1 材料与方法
1.1 样本预处理

选取本实验室日常检案积累需要亲权鉴定的各类长骨25根, 牙齿25颗, 其中三联体亲权鉴定11份, 二联体亲权鉴定39份。参照文献[1, 2]中的方法进行前期处理和后期消化。用手术刀刮净其表面, 清洗。紫外灯下照射2 h, 骨骼用电钻钻取约500 mg骨粉备用, 牙齿用牙齿粉碎器砸成粉末备用。

1.2 主要仪器与试剂

Identifiler Plus试剂盒(美国ABI公司), Global Filer™ 试剂盒(美国ABI公司), 3500XL基因分析仪(美国ABI公司), 9700型扩增仪(美国ABI公司), 电钻、牙齿粉碎器(公安部物证鉴定中心)。

1.3 实验方法

取骨粉及牙粉分别置于1.5 mL离心管中, 加入400μ L EDTA脱钙液(0.5 mol/L, pH 8.0), 10 μ L DTT溶液(4 mol/L)、20 μ L蛋白酶K溶液(20 mg/mL), 充分混匀, 在56℃的恒温混匀仪上酶解12 h以上, 采用硅珠法[3]进行提取纯化, 30 μ L洗脱体系。获得的模板DNA采用GlobalFiler™ 试剂盒10 μ L扩增反应体系, DNA模板加入6μ L。按照产品说明书推荐程序在9700型扩增仪中进行29次循环扩增。扩增产物用3500XL型基因分析仪进行电泳分离, STR分型结果使用GeneMapper ID-X v1.4进行分析。

2 结 果

检验结果判定以峰高> 100 RFU(相对荧光单位)视为成功检出。50份检材均成功检出STR分型, 检出率为100%。STR分型均较平衡。同时, 在一份男性骨骼样本中, 之前采用Identifiler Plus试剂盒扩增的分型中Amelogenin基因座出现了Y等位基因丢失的现象, 导致结果容易误判为女性分型(见图1)。GlobalFiler™ 试剂盒扩增的分型中Amelogenin基因座Y等位基因也同样出现了丢失现象, 但Y-indel和DYS391两个基因座均扩增出了等位基因, 确证该骨骼样本为男性样本, 而不是女性(见图2)。

图 1 Identifiler Plus试剂盒的分型结果Fig.1 Genotyping with Identifiler Plus kit

图 2 GlobalFiler™ 试剂盒的分型结果Fig.2 Genotyping with GlobalFiler™ kit

3 讨 论

白骨化陈旧骨骼、牙齿等, 由于DNA含量低, 又有坚硬的细胞外基质保护, 使得此类生物检材的检验难度较大。GlobalFiler™ 试剂盒采用了6色荧光技术, 对电泳仪的要求更高, 所以未能得到广泛应用, 对于其在案件检验中的效果, 目前也鲜有报道。但其复合扩增包含的基因座比较多, 除了包含目前广泛使用的Identifiler Plus试剂盒的15个基因座和性别基因座外, 又增加了另外6个常染色体基因座D22S1045、SE33、D10S1248、D1S1656、D12S391、D2S441, 同时还增加了Y-indel和DYS391两个Y染色体遗传标记。试剂盒基因座的扩增片段除了SE33大于400 bp之外, 其余基因座都在400 bp以内, 整体片段长度较短, 有利于提高扩增成功率。本实验中50份骨骼、牙齿类检材的成功检出说明对于疑难的骨骼牙齿类检材, GlobalFiler™ 试剂盒完全能够成功扩增。

在本实验中, GlobalFiler™ 试剂盒一次扩增可以获得21个常染色体基因座STR分型结果, 联合应用进行亲权鉴定的累积非父排除率(CPE)达0.999 999 9。而Identifiler Plus试剂盒包含的15个STR基因座联合应用进行亲权鉴定的累积非父排除率(CPE)为0.999 998 8。相比Identifiler Plus试剂盒而言, GlobalFiler™ 试剂盒具有更高的系统效能。从实验获得的STR分型来计算累积父权指数(CPI值)可以看出(见表1), 11份三联体的尸源认定中, 两种试剂盒计算得到的CPI值均能达到10 000以上, 但GlobalFiler™ 试剂盒得到的CPI值更高, 其中10份能达到108以上。39份二联体的尸源认定中, GlobalFiler™ 试剂盒得到的CPI均能达到10 000以上, 而Identifiler Plus试剂盒得到的CPI值只有30例在10 000以上。

表 1 Identifiler Plus和GlobalFiler™ CPI值比较 Table 1 CPI values obtained with Identifiler Plus and GlobalFiler™

GlobalFiler™ 试剂盒中包含的Y-indel和DYS 391两个基因座对于某些Amelogenin基因座Y等位基因丢失的白骨化尸体的性别鉴定很有意义。目前, 男性Amelogenin基因座Y等位基因丢失的案例屡有报道[4, 5]。Amelogenin性别基因座位于Y染色体的短臂, 而Y-indel和DYS391位于Y染色体的长臂区域, 而且Y-indel插入缺失多态性位点非常短(60 bp), 如果DYS391发生缺失的时候, 对极度降解样品也仍然有高分辨能力。额外的性别鉴定标记可以在Amelogenin基因座Y等位基因丢失的情况下, 保证能够准确鉴定白骨化尸体的性别, 这对于尸源认定很有帮助, 可以避免由于Y等位基因的丢失而将男性尸骨误判为女性尸骨。本实验中的一份骨骼样本经Identifiler Plus试剂盒扩增后结果显示为一女性分型, 而经GlobalFiler™ 试剂盒扩增后提示该骨骼样本应为男性。可见, 对于此类Amelogenin基因座Y等位基因丢失的检材, 采用GlobalFiler™ 试剂盒扩增, 可以有效避免对该类尸骨的性别误判, 避免给侦查工作带来困扰。

此外, GlobalFiler™ 试剂盒扩增时间更短, 只需80 min。并且对于骨骼牙齿类检材来说, 一般DNA模板含量较少, 采用无水扩增时, 10 μ L体系下, GlobalFiler™ 试剂盒的模板体积可到6 μ L, 相对提高了模板DNA浓度, 也在一定程度上提高了检测成功率, 对于微量骨骼DNA模板, 可以尝试GlobalFiler™ 试剂盒。

综上, GlobalFiler™ 试剂盒在检出率、平衡性方面也都能够满足检验需要, 尤其是只需一次检验即可得到21个常染色体STR 基因座和3个性别基因座的分型信息, 不仅在单次检验中提供的基因座更多, 可显著提高累积亲权指数, 而且可以有效避免Amelogenin基因座Y等位基因丢失时导致的无名尸体性别误判, 在白骨化尸体身源认定中具有较高的应用价值。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
[1] 涂政, 刘志芳, 陈松, . 牙齿的DNA提取及STR分型研究[J] . 刑事技术, 2007(5): 9-10. [本文引用:1]
[2] 涂政, 陈松, 赵龚, . 66年骨骼检验1例[J] . 刑事技术, 2011(3): 48-49. [本文引用:1]
[3] 王林生, 苏勇, 顾林岗. 硅珠法提取PCR模板DNA[J] . 中国法医学杂志, 2000, 15(1): 36-37. [本文引用:1]
[4] 洪强, 薛佳, 陶莉, . Y染色体DNA分型异常2例[J] . 中国法医学杂志, 2014(1): 23. [本文引用:1]
[5] Chang YM, Perumal R, Keat PY, et al. A distinct Y-STR haplotype for Amelogenin negative males characterized by a large Yp11. 2 (DYS458-MSY1-AMEL-Y) deletion[J] . Forensic Sci Int, 2007, 166(2): 115-120. [本文引用:1]