测序的策略根据测序目的以及测序平台的不同而有不同选择。根据获得线粒体DNA方法的不同可将测序分为直接测序和间接测序。直接测序是指先通过DNA提取或扩增获得足够的线粒体DNA后对其进行测序^[13]。由于检材量的限制, 直接提取得到的DNA量往往非常有限, 通常需对线粒体DNA进行PCR扩增或探针捕获^[14]进行富集后测序。对于线粒体DNA 16569 bp全基因组的扩增, 需使用多对引物进行分段扩增。有文献推荐使用65对引物^[15]或34个扩增片段^[16]对线粒体全基因组进行分段扩增, 也有报道仅使用12对相互重叠的引物也能获得良好的线粒体全基因组扩增效果^{[7, 8]}。由于法医鉴定中的检材大部分为降解检材, 为了提高DNA的检出率, 测序的策略应尽量采用较小的扩增片段, 并且为避免扩增片段间的相互干扰, 还应该减少不必要的扩增子数目。对于线粒体DNA而言, 因其序列包含较多高变位点, 且存在与核染色体高度同源的序列, 使得线粒体测序策略的选择有一定难度。Fendt等^[17]先将16 kb长的线粒体DNA扩增为A、B两个约8.5 kb长的片段, 然后用48对测序引物对上述两个长片段进行测序。此方法适合于DNA质量较好的线粒体样本。Lyons等^[18]利用Sanger法对人群的线粒体全基因组进行测序, 采用的是将16 kb的线粒体全基因组序列在96孔板中分成8个扩增子进行扩增, 然后再利用多个测序引物进行多重扩增, 共将其分为135个片段来进行测序。此方法大大降低了核线粒体DNA（nuclear mitochondrial DNA, NUMT）的干扰, 使得测序DNA起始用量降至50 pg~1 ng。间接测序是指先通过测序得到样品所有的DNA序列信息后, 通过生物信息学的方法将线粒体DNA序列筛选出来。此方法很难进行质量控制, 也极易受假阳性和核DNA的干扰。在二代测序方面, Mikkelsen等^[19]用二代测序平台对10个无关个体的线粒体全基因组进行了检测, 采用的是将整个线粒体DNA片段分为2个扩增子进行测序。Schonberg^[20]和Templeton^[21]等也是先将线粒体DNA分成2个片段进行特异扩增后, 再用物理方法将其打断为适当大小的片段进行测序。此方法虽然可以减少其它非线粒体DNA的污染, 但是如此大的扩增子在法医降解检材中很难扩增得到, 而Templeton等在扩增片段前还利用探针捕获的方法对线粒体DNA进行富集, 能够明显提高二代测序的数据质量。

线粒体DNA的异质性, 是指在同一个来源的线粒体基因组中, 同一位置上出现两种或两种以上的分子类型。现在的研究多认为异质性的产生跟瓶颈理论^[22]有关, 且多发生在高代谢的组织上, 如毛发等。线粒体的异质性可分为两种, 一种是长度异质性（length heteroplasmy, LHP）, 另一种为点异质性（point heterolasmy, PHP）^[4]。异质性的发生类型多种多样, 包括：同一组织来源, 不同细胞间; 同一细胞, 不同线粒体拷贝间; 同一线粒体中, 不同线粒体DNA分子间^[23]。异质性的出现, 为法医线粒体DNA鉴定带来一定挑战。但需要注意的是, 异质性并非出现于线粒体基因组的必然之物。传统异质性的研究是通过Sanger法测序获得的, 但通过Sanger法判断点异质性易受到引物或者异质点位置的干扰, 且没有一个确定的异质性标准, 灵敏度也较低; 而利用二代测序的方法, 能够得到整个线粒体DNA序列的异质性位点信息, 并且由于是通过双向测序获得, 其结果更加准确可靠。通过目前二代测序对线粒体DNA异质性的研究表明, 线粒体DNA异质性的发生率要高于以往的研究结果^[4], 但到底是由于检测方法敏感度的增加导致的假阳性还是由于异质性的确比之前认为的更易发生, 以及如何将此方面研究应用于法医学实际案例, 尚需进一步深入研究。除此之外, 为了避免不完整测序造成的将可能的单倍型误认为变异, 现在一些线粒体DNA数据库以全基因组范围的单倍群为基础^[24]。

早在新的测序方法出现前便有学者研究发现线粒体的全基因组测序相较于高变区的测序有更高的识别能力^[8], 但由于种种限制使得通过将编码区的SNP位点联合高变区测序成为全基因测序的替代^[8], 但这始终无法达到全基因组测序的高分辨率。新的技术出现后, 许多学者便尝试将其用于法医学的研究, 包括Loreille等^[26]利用二代测序平台对高度降解的未知名骨骼样本进行了线粒体全基因组测序。King等^[27]对2014年英国出土的怀疑为理查三世的尸骨进行了鉴定, 通过Y染色体、线粒体和表观遗传SNP相关位点的联合应用确认该遗骨确为理查三世。其中线粒体就是采用DNA杂交捕获后的长片段扩增, 在二代测序平台上获得全基因组数据, 并得到了完美比对结果。另外, 因为对于一些稀有的疑似单倍型的判断依赖于准确的人群调查, 已有的数据大多仅基于非编码区的数据, 而随着越来越多的认识发现线粒体全基因组的分析更全面和准确, Just等^[28]便用高通量的Sanger测序法对3个民族588个美国个体进行全基因组测序, 为将来的全基因组比对提供了更好的基础支持。除此之外, Bouhlal等^[29]通过二代测序的方法辅以一代验证对一对同卵双胞胎进行了线粒体全基因组测序, 发现了低频率的不同的异质性位点, 但考虑到核DNA的干扰, 且该实验也缺乏不同年龄段的参考数据, 因此有待进一步研究证实。

由于线粒体在体内的主要功能是氧化供能, 其变异极有可能导致疾病的发生。将线粒体单倍群与一些相关疾病, 如白血病、Ⅱ 型糖尿病^[30]、老年痴呆症^[31]等进行相关性研究发现线粒体全基因组的单倍型类型是疾病发生的相关因素。由于全基因组检测技术的普及, 使得线粒体基因的功能研究能够进一步深入。Atilano等^[32]使用了分子克隆和线粒体全基因测序的方法, 确认了不同单倍群对甲基化的差别调控影响了炎症反应。另外, Zaragoza等^[10]利用全测序分析的方法对母系遗传的心肌病病人进行线粒体测序, 发现了更多与疾病相关的变异位点。

氧化应激是人体衰老的分子机制之一, 当细胞出现氧化剂和抗氧化剂的不平衡时便会导致氧化应激的累积。现在认为在氧化磷酸化过程中产生的活性氧作为强氧化剂对细胞的老化有重要的作用, 线粒体作为细胞内重要的产生活性氧的器官便在衰老的过程中起着重要的作用^{[33, 34]}。随着年龄增长, 线粒体发生的变异也明显增多, 目前也尚未明确是由于衰老导致的变异还是由变异造成的衰老, 许多实验也能明显观察到随着年龄增长线粒体基因组的变异也随之增加^[35]。新的技术为线粒体全基因的变异检测提供了新的解决方案, 为线粒体和核DNA的联合分析提供了可能^[36]。能否将线粒体全基因的变异与死亡年龄推断联系起来应用于法医实际应用中^[37], 有待进一步的研究。