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张大雷, 张吉林, 才志成, 陈奇, 廖林川. GC/MS衍生化法检测血中4-溴-2, 5-二甲氧基苯乙胺[J]. 刑事技术,2015,40(1): 40-44
ZHANG Da-lei, ZHANG Ji-lin, CAI Zhi-cheng, CHEN Qi, LIAO Lin-chuan. Determination of 4-bromo-2, 5-dimethoxyphenethylamine in Blood by GC/MS Combined Derivatization Method[J]. Forensic Science and Technology,2015,40(1): 40-44  
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GC/MS衍生化法检测血中4-溴-2, 5-二甲氧基苯乙胺
张大雷1,2, 张吉林2, 才志成2, 陈奇3, 廖林川1
1.四川大学华西基础医学与法医学院,成都 610041
2.黑龙江省公安厅刑事技术总队,哈尔滨 150008
3.哈尔滨商业大学药物研究所,哈尔滨 150076

作者简介：张大雷（1977—）,男,黑龙江大庆人,高级工程师,博士,研究方向为理化检验技术。E-mail:zdlahf@163.com

基金: 公安部应用创新计划项目（No.2012YYCXHLJST031）
摘要

目的 建立人体全血中4-溴-2, 5-二甲氧基苯乙胺的衍生化GC/MS分析方法。方法 血液样品经去离子水稀释4倍,8000r/min高速离心20min后,加入NaH2PO4缓冲溶液（pH值为6.0）2mL,混匀。将上述混合液加入用甲醇、NaH2PO4缓冲溶液（pH值为6.0）活化的Bond Elut Centify®固相萃取柱后,依次采用1.0M乙酸溶液、去离子水、甲醇、二氯甲烷/异丙醇/氨水（78/20/2,V/V/V）混合洗脱液进行提取、分离、净化处理,40℃空气流下挥干,三氟乙酸酐衍生化,GC/MS检测4-溴-2, 5-二甲氧基苯乙胺和4-苯基丁胺衍生物。采用标准品衍生化产物的标准质谱图定性分析,选择m/z 242（4-溴-2, 5-二甲氧基苯乙胺）、m/z 91（4-苯基丁胺）作为定量离子进行定量分析。结果 血液中4-溴-2, 5-二甲氧基苯乙胺的最低检出限为6ng/mL,在0.02~10µg/mL浓度范围内,线性关系良好（=0.9993）,日内精密度和日间精密度均小于10%,平均提取回收率约为69%。结论 该方法操作简便、灵敏度高,适用于全血中4-溴-2, 5-二甲氧基苯乙胺检测。

关键词: 法医毒物分析; 4-溴-2; 5-二甲氧基苯乙胺; GC/MS; 血液
中图分类号:DF795.1 文献标志码:A 文章编号:1008-3650(2015)01-0040-05 doi: 10.16467/j.1008-3650.2015.01.009
Determination of 4-bromo-2, 5-dimethoxyphenethylamine in Blood by GC/MS Combined Derivatization Method
ZHANG Da-lei1,2, ZHANG Ji-lin2, CAI Zhi-cheng2, CHEN Qi3, LIAO Lin-chuan1
1. West China School of Preclinical and Forensic Medicine, Sichuan University, Chengdu 610041, China
2. Forensic Science Section, Heilongjiang Public Security, Harbin 150008, China
3. Institute of Materia Medica, Harbin University of Commerce, Harbin 150076, China
Abstract

Objective To establish a GC/MS derivatization method for determining the 4-bromo-2, 5-dimethoxy-phenethylamine in blood.Methods Blood sample was extracted and purified by Bond Elut Centify® solid phase extraction column after diluted to four times by deionized water. The residuum was derivatized by trifluoroacetic anhydride. 4-bromo-2, 5-dimethoxyphenethylamine and 4-phenylbutylamine (internal standard) were analyzed by gas chromatography-mass spectrum. The ions m/z 242 and m/z 91 were applied in quantitative analysis for 4-bromo-2, 5-dimethoxyphenethylamine and 4-phenylbutylamine, respectively.Results The limit of detection was 6 ng/mL in blood sample and the calibration curve was linear in the range of 0.02~10μg/mL (=0.9993) for 4-bromo-2, 5-dimethoxyphenethylamine. The RSDs of intra-day and inter-day were less than 10%; the average extraction recovery of 4-bromo-2, 5-dimethoxyphenethylamine was about 69%.Conclusions This method is rapid, sensitive and suitable for qualitative analysis of 4-bromo-2, 5-dimethoxyphenethylamine in blood.

Keyword: forensic toxicological analysis; 4-bromo-2; 5-dimethoxyphenethylamine; GC/MS; blood

4-溴-2, 5-二甲氧基苯乙胺（2C-B）1974年由Alexander Shulgin首次合成并发现其有精神作用[1]。上世纪90年代开始, 一些国家先后发现该物质出现被滥用的情况, 随即WHO和美国、瑞士等国家相继将其列为管制药品并禁止使用[2, 3, 4]; 我国于2001年将其列入Ⅰ 类精神药品品种目录[5]。有报道称该化合物具有兴奋和致幻双重精神作用, 强度是4-溴-2, 5-二甲氧基苯丙胺强的10倍。随着服用剂量的升高, 首先出现兴奋、松弛、消极的精神感觉, 并随着剂量的增加不断增强, 同时各种感官出现不同程度的欣快、兴奋, 最后直至出现幻觉或达到妄想的状态, 持续时间可达到6h左右, 会引起身体严重的毒性副作用[1, 3, 6]。4-溴-2, 5-二甲氧基苯乙胺的化学结构见图1。

图1 4-溴-2, 5-二甲氧基苯乙胺的化学结构Fig. 1 Chemical structure of 4-bromo-2, 5-dimethoxyphenethylamine

目前国际上对生物检材中的4-溴-2, 5-二甲氧基苯乙胺的检测方法报道不多, 主要是采用液-液或固相萃取的方法提取生物检材后, 采用气相色谱法（GC）、气相色谱-质谱联用法（GC/MS）、高效液相色谱法（HPLC）和液相色谱-质谱联用法（LC/MS）分析4-溴-2, 5-二甲氧基苯乙胺原体成分[6, 7, 8, 9]。国内尚无血液中检测方法报道。鉴于生物检材的基质干扰及该化合物的信号响应低等情况, 为提高检验的灵敏度, 本文拟建立衍生化GC/MS法检测血液中4-溴-2, 5-二甲氧基苯乙胺的方法, 为今后法医毒物分析和吸毒人员检测提供灵敏、快速的分析方法。

1 材料与方法
1.1 仪器与试剂

仪器：7890A/5975C气质联用仪, 配EI源（美国Agilent公司）; TJ-6高速离心机（美国BECKMAN公司）; VORTEX-GENIE 2旋涡混合器（美国Scientific Industries公司）; Milli-Q超纯水机（美国Millipore公司）; AB135-S分析天平（瑞士METTLER TOLEDO公司, 0.01mg）; pH计（瑞士METTLER TOLEDO公司）; DSY-Ⅱ 型自动快速浓缩仪（北京金科精华苑技术研究所）; CNW 12固相萃取装置（德国CNW公司）; Bond Elut Centify® SPE柱（填料：C8和苯磺酸, 3mL, 美国Agilent公司）。

试剂：4-溴-2, 5-二甲氧基苯乙胺盐酸盐（纯度95%, 黑龙江大学化学化工学院合成）; 4-苯基丁胺（SIGMA-ALDRICH公司, 纯度 98%, 密度 0.944）; 甲醇、二氯甲烷、异丙醇、乙酸乙酯（DIKMA公司）; 氨水、三氟乙酸酐、NaH2PO4（SIGMA-ALDRICH公司）。

1.2 色谱质谱条件

色谱条件：色谱柱：Agilent DB-1MS（30m× 0.25mm× 0.25μ m）; 程序升温：110℃开始, 保持2min, 以10℃/min升至280℃, 保持15min; 进样口温度：250℃; 载气：高纯He, 流速1mL/min; 进样量：1μ L。

质谱条件: MSD传输线温度270℃; 离子源温度230℃; 四极杆温度150℃; 电子轰击源能量：70eV; 溶剂延迟时间：3.5min; 全扫描模式（40~500, m/z）; 选择离子扫描 m/z 242（4-溴-2, 5-二甲氧基苯乙胺）, m/z 91（4-苯基丁胺）。

1.3 溶液配制

标准溶液：精密称取4-溴-2, 5-二甲氧基苯乙胺盐酸盐0.01201g于10mL容量瓶中, 甲醇定容, 配成浓度为1mg/mL的标准储备液; 临用时用甲醇稀释成0.5, 25, 50, 100, 150, 200, 250μ g/mL的系列浓度的标准工作液。

内标溶液：精密称取4-苯基丁胺2.700mL于25mL容量瓶中, 甲醇定容, 配成浓度为0.1 mg/mL的内标工作液。

1.4 样品处理

提取：取血液样品0.5mL, 加入2μ g 4-苯基丁胺（内标）, 去离子水稀释4倍, 8000r/min离心20min, 取上清液, 加入NaH2PO4缓冲溶液（pH值为6.0）2mL, 混匀。

净化：依次用2mL甲醇, 2mLNaH2PO4缓冲溶液（pH值为6.0）活化固相萃取柱。将处理过的血液样品加载过柱后, 依次用1.0 mol/L乙酸溶液1mL, 去离子水3mL淋洗, 甩干小柱; 再用甲醇6mL淋洗, 8000r/min离心5min, 甩干小柱; 3mL二氯甲烷/异丙醇/氨水（78/20/2, V/V/V）混合溶液洗脱, 40℃空气流下挥干。

衍生：向挥干洗脱液的试管中加入乙酸乙酯、三氟乙酸酐（TFAA）各30μ L, 密封, 60℃水浴30min, 取出挥干, 50μ L乙酸乙酯定容。

2 结 果
2.1 总离子流色谱图

空白血液中添加一定浓度4-溴-2, 5-二甲氧基苯乙胺工作液和内标, 按1.4项操作, 研究了不同初始温度和升温速率对检测结果的影响, 得到1.2项条件符合4-溴-2, 5-二甲氧基苯乙胺检测的需要, 见图2。同空白血液同法操作后比较, 结果为4-溴-2, 5-二甲氧基苯乙胺衍生产物和内标4-苯基丁胺衍生产物的保留时间分别为13.3min和8.7min, 理论塔板数按4-溴-2, 5-二甲氧基苯乙胺衍生产物计算不低于1.0× 104, 血液中内源性物质不干扰4-溴-2, 5-二甲氧基苯乙胺和内标的检测。

图2 4-溴-2, 5-二甲氧基苯乙胺（1）和4-苯基丁胺（2）血液样品总离子流图。A：空白血液; B：血液 + 4-溴-2, 5-二甲氧基苯乙胺和4-苯基丁胺。Fig. 2 Total ion chromatography of 4-bromo-2, 5-dimethoxyphenethylamine (1) and 4-Phenylbutylamine (2) in blood. A: blank blood; B: blank blood + 4-bromo-2, 5-dimethoxyphenethylamine and 4-Phenylbutylamine.

2.2 质谱分析

在优化好的条件下, 分析后得到4-溴-2, 5-二甲氧基苯乙胺衍生产物和内标4-苯基丁胺衍生产物的特征质谱图, 如图3。采用选择离子监控模式（SIM）进行定量分析, 其定量离子分别为m/z 242和m/z 91。

图3 4-溴-2, 5-二甲氧基苯乙胺TFAA衍生物（A）及4-苯基丁胺TFAA衍生物（B）质谱图Fig. 3 Mass spectra of 4-bromo-2, 5-dimethoxyphenethylamine (A) and 4-Phenylbutylamine (B) derivatives with TFAA

2.3 线性关系及检测限

精密量取空白血液0.5mL, 分别加入不同浓度的4-溴-2, 5-二甲氧基苯乙胺系列标准溶液20μ L、内标工作液20μ L, 制成血浆中4-溴-2, 5-二甲氧基苯乙胺浓度分别为0.02、1、2、4、6、8、10 μ g/mL的血液添加样品。按1.4项下方法操作处理, 分别记录分析所得数据。以4-溴-2, 5-二甲氧基苯乙胺浓度为横坐标, 4-溴-2, 5-二甲氧基苯乙胺与内标物峰面积比值为纵坐标, 以最小二乘法回归运算, 得到标准曲线回归方程为Y = 0.299X + 0.05, r = 0.9993。结果表明, 4-溴-2, 5-二甲氧基苯乙胺在此色谱条件下0.02~10μ g/mL浓度范围内, 线性关系良好, 可以满足临床药物监测和法医毒物分析实际工作需要。

按信噪比为1: 3确定最低检测限、信噪比为1: 10确定定量限。测得4-溴-2, 5-二甲氧基苯乙胺最低检测限为6ng/mL, 定量限为17ng/mL。

2.4 精密度与稳定性

取空白血液0.5mL, 按照2.3方法配制4-溴-2, 5-二甲氧基苯乙胺高、中、低3个浓度（分别为10、4、0.02μ g/mL）的质控样品, 按1.4项操作处理, 测定3d, 得4-溴-2, 5-二甲氧基苯乙胺与内标物峰面积比值, 按照线性回归方程计算准确度、日内和日间精密度。结果见表1, 高、中、低浓度（10、4、0.02μ g/mL）血样测定准确度分别为101%, 95%和97%, 日内和日间RSD均小于10%。

表1 血液中4-溴-2, 5-二甲氧基苯乙胺的精密度、提取回收率（n=5） Table 1 Precision and recovery of 4-bromo-2, 5-dimethoxyphenethylamine in human blood (n=5)
2.5 回收率

取空白血液0.5mL, 按照2.3方法配制4-溴-2, 5-二甲氧基苯乙胺高、中、低3个浓度（分别为10、4、0.02μ g/mL）的血液样品各5份, 按1.4项操作处理, 得4-溴-2, 5-二甲氧基苯乙胺衍生物峰面积A1。取空白血液 0.5mL, 直按1.4项操作处理后, 添加相应4-溴-2, 5-二甲氧基苯乙胺标准工作液各5份, 衍生化、吹干、溶解后进样, 得4-溴-2, 5-二甲氧基苯乙胺衍生物峰面积A2。

回收率公式为：回收率= A1 / A2× 100%。按照公式计算, 测得的回收率见表1, 平均回收率为69.5%。

3 讨 论

本方法选用应用广泛的GC/MS作为分析仪器, 适应当前药物检测和法医毒物分析工作的需要, 经过反复进样分析, 确定起始温度为110℃, 升温速率不宜过快, 为10℃/min, 较好地保证了被检测组分的完全分离。结果表明, GC/MS 对该化合物的响应值好, 检测灵敏度高, 适用于血液样品中4-溴-2, 5-二甲氧基苯乙胺成分的分析。

4-溴-2, 5-二甲氧基苯乙胺属于苯乙胺类化合物, 由于结构中含有氨基, 化合物呈碱性, 选用阳离子交换SPE柱进行样品的提取、净化处理, 可消除血液中酸性、中性化合物对检测的干扰。Theobald DS等曾报道过体内生物样品中碱性药品使用碱性阳离子交换SPE柱进行样品的前处理方法, 这与本方法选用varian Bond Elut Centify® SPE柱处理样品的原理相同[10, 11, 12]。本研究选用该SPE柱处理4-溴-2, 5-二甲氧基苯乙胺可以达到较好的样品前处理效果, 血液添加样品的提取回收率高, 效果较好。

三氟乙酸酐作为常用的衍生化试剂运用于本方法中, 不仅可以提高产物的气化效果, 而且可以增加质谱的响应值, 进而提高了检测灵敏度。有报道称应用三氟乙酸酐衍生化的方法检测生物样品中甲基苯丙胺、氯胺酮等毒品成分, 使检测的灵敏度有较大提高[13, 14]。研究选用三氟乙酸酐作为衍生化试剂, 衍生化产物产率高、稳定性好, 其他干扰物质衍生化产物不影响4-溴-2, 5-二甲氧基苯乙胺定性、定量分析。

目前, 4-溴-2, 5-二甲氧基苯乙胺作为新兴毒品成分, 已在我国发现并有逐步扩大滥用的趋势。建立血液样品中该成分的分析方法势在必行, 本研究建立了固相萃取方法提取、净化血液中4-溴-2, 5-二甲氧基苯乙胺成分, 采用衍生化GC/MS全扫描方法进行定性分析, 选择离子模式进行定量分析。方法简便、灵敏、可靠, 适用于吸毒人员临床药物监测和法医毒物分析的需要。

The authors have declared that no competing interests exist.

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