引用本文
刘亚举, 张俊涛, 史绍杏. 改良直接扩增法应用于生物检材DNA检验[J]. 刑事技术,2014,39(6): 55-56
[J]. Forensic Science and Technology,2014,39(6): 55-56  
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改良直接扩增法应用于生物检材DNA检验
刘亚举1, 张俊涛2, 史绍杏3
1.河南许昌市公安局刑事科学技术研究所,461000
2.河南襄城县公安局刑侦大队,461700
3.河南南阳市公安局刑事科学技术研究所,473000
摘要
关键词: 法医物证学; 直接扩增法; 血痕类; 唾液斑; 肋软骨; STR; DNA
中图分类号:DF795.2 文献标志码:B 文章编号:1008-3650(2014)06-0055-02

Identifiler® Plus 试剂盒性能卓越, PCR反应液经过优化, 抗抑制剂能力强, 适用于案件生物检材DNA检验[1]。本文利用纳米银溶液和生物物证提取棉签、植绒拭子对案件常见的血痕类、唾液斑和肋软骨等进行检材转移, 采用Identifiler® Plus扩增系统配以Prep-n-Go Buffer进行直接扩增检验, 以探讨直接扩增技术对此类检材的有效性和可靠性。

1 材料与方法
1.1 样 本

实验室日常受理检验的案件生物检材317份, 包括:血痕类112份(承载体如玻璃、桌子、柜子、光滑棍棒、刀具、瓷砖、水泥地面), 烟蒂80份, 肋软骨15份, 可疑脱落细胞类检材80份(饮料瓶口), 人体身上粘附物30份(指甲上5份、颈部5份、乳头处15份、阴茎上5份)。

1.2 仪器与试剂

9700型PCR扩增仪、3500XL型遗传分析仪和ID-X分析软件、Prep-n-Go®缓冲液、Identifiler® Plus Kit(AB公司, 美国); 4N6FLOQSwabsTM植绒拭子套装(COPAN公司, 意大利); 生物物证保存盒及棉签和纳米银溶液(公安部物证鉴定中心)。

1.3 方 法

1.3.1 检材预处理 (1)血痕类:用移液器吸取20μ L浅黄色的纳米银溶液滴到尖形棉签顶部, 使之半湿润, 擦拭过程中尽量用顶端部, 轻轻擦拭载体上的血迹, 然后剪取约0.8mm直径棉球; (2)烟蒂:在唾液斑痕处剪取约1.5mm× 1.2mm大小; (3)肋软骨:切取约1.2mm× 1.2mm× 1.2mm大小; (4)饮料瓶口:操作方法略同“ 血痕类” , 其中用棉签40份、植绒拭子40份, 均剪取约1.2mm直径擦拭物; (5)人体身上粘附物:操作方法略同“ 血痕类” , 全部用植绒拭子擦拭, 擦拭时来回拭抹、旋转拭子表面、力度适中, 最后剪取约1.2mm直径擦拭物。经处理过的检材放入0.2mL的PCR管(鼓盖)中, 在管盖作上标记号。

1.3.2 PCR扩增及分型 采用12.5μ L扩增体系, 在预处理检材中, 直接加入Prep-n-Go®缓冲液2.5μ L, 以离心半径9.5cm、10000r/min、离心10s, 然后在室温中静置10min, 最后加入10μ L的PCR反应混合液(Master Mix5μ L、Primer Set2.5μ L、纯水2.5μ L)。置于9700型扩增仪上按标准程序29个循环进行复合扩增。按照试剂盒说明书, 在3500XL型遗传分析仪上全自动毛细管电泳, Collection软件收集数据, 用GeneMapperID-X软件进行等位基因分型。

2 结 果

以获得性别及13个以上STR基因座明确分型的为成功, 其中大部分检材的峰值范围为700~7500RFU、杂合子两个峰高比例> 70%、同一荧光基因座峰高比例> 50%, 但有小片段基因座出现双肩峰(见图1、图2)。不同种类检材的检验成功率不大相同, 317例各类生物检材检验结果见表1。

图1 某火场中死者(男, 21岁)肋软骨STR分型

图2 某案受害人(女)左侧乳房植绒拭子擦拭STR分型

3 讨 论

为了得到有效生物检材, 衔接实验室DNA检出率, 勘验人员必须在案件现场及时将生物检材转移到满足要求的载体上。在生物检材转移过程中, 一般采用浅黄色的纳米银溶液(纳米银含量50~200ppm、pH7.0~8.0)和生物物证提取棉签、植绒拭子, 由于纳米银单体具有小尺寸表面效应, 渗透性强, 能与人体细胞特异性结合, 可以最大限度地将细胞富集转移, 同时其还具有杀菌防腐作用, 在该浓度和pH环境里延缓了细胞的衰老降解; 提取后, 包装在透气的纸质盒和光管里, 方便送检。直接剪取烟蒂和血痕用棉签转移实现了较高的检出率; 从饮料瓶口用棉签和植绒拭子擦拭的检出成功率来看, 棉签82.5%、植绒拭子95%, 虽然有个体差异, 但也有下述因素:植绒拭子是利用专利技术的尼龙纤维植绒填充, 尼龙纤维垂直于基底, 使整个样本采集区域无内部吸收孔, 从而达到快速且完全的样本吸附和出色的洗脱、释放, 而棉签则会有样本分散且滞留在缠绕的纤维团中。因此, 建议微量生物检材进行直接扩增, 采用植绒拭子转移检材较好。

表1 采用改良直接扩增法各类生物检材DNA-STR检验结果

乳头、阴茎上比颈部、指甲上DNA检出率高, 分析有以下原因:(1)发力部位、力的作用度及受力部位; (2)细胞种类及含量:乳头、阴茎皮肤是表皮上皮细胞, 遗留其上的唾液、唇粘膜或阴道分泌液是粘膜上皮细胞, 粘膜上皮细胞数量远大于表皮上皮细胞; 而颈部扼痕遗留的是手和颈部的表皮细胞。另外, 本文检验样本中的肋软骨成功率也很高, 可能与肋软骨均较为新鲜(色泽为白色、米黄色), 或为保存条件较好的干燥样本, 以及死者的年龄较小(钙化程度轻)有关, 对于陈旧或已出现腐败和钙化较重的样本的检验结果还需进一步的研究证实。

Identifiler Plus 试剂盒中的PCR Buffer增加了增强剂和抗抑制剂[1], 可以抵抗检材基质上的抑制剂[2]; 能够提高混合生物检材中小浓度DNA的检测, 也就是改善大浓度DNA和小浓度DNA峰的平衡性, 提高混合STR分型的解释。Prep-n-Go缓冲液能使峰均衡性好、得到好的峰高(尤其是大片段的扩增子)、减少杂峰, 经过其预处理, 使部分细胞裂解、核DNA被释放[3]。Prep-n-Go和PCR Buffer联合效能, 可以得到最大化的核DNA量, 再经过29个循环扩增, 所检出的STR峰型尖锐清晰、平衡性好, 但也有表现为小片段基因座出现双肩峰, 因此就要不断摸索调整检材量或改为28个循环数、以及将60℃延伸改为25min、提高进样电压和延长进样时间等。

综上所述, 案件中无污染的擦拭类血痕、唾液斑和肋软骨、烟蒂检材, 可采用Identifiler Plus试剂盒进行直接扩增, 方法简单、快速稳定、检材量小, 缩短了DNA检验时间, 可在实际检案中选用, 但为了检材被充分浸没, 避免扩增过程中出现干管, 建议采用12.5μ L体系。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
[1] Dennis Y, Wang, Chien-WeiChang, Robert E, Lagacé, et al. Developmental validation of the ampFLSTR® identifiler plus® PCR amplification kit: An established multiplex assay with improved performance[J]. J Forensic Sci, 2012, 57(2): 453-465. [本文引用:2]
[2] Bu Y, Huang H, Zhou G. Direct polymerase chain reaction(PCR)from human whole blood and filter-paper-dried blood by using a PCR buffer with a higher pH[J]. Anal Biochem, 2008, 375(2): 370-372. [本文引用:1]
[3] Adrian L, Vera P, Yuvaneswari C S, et al. Generation of DNA profiles from fabrics without DNA extraction[J]. Forensic Sci Int(Genetics), 2010, 4: 137-141. [本文引用:1]