9700 型扩增仪(美国AB公司), 3130XL 遗传分析仪(美国AB 公司), DNA IQ^TMSystem 试剂盒(美国Promega 公司), Goldeneye 20A^TM试剂盒(北京基点认知技术有限公司), Promega PP21试剂盒(美国Promega公司), EX20试剂盒。

日常检案中1例三联体亲权鉴定, 采取争议父亲、母亲和孩子的血样各1份。3份血样均用DNA IQ^TM试剂盒提取样本基因组DNA。

(1)用Goldeneye 20A^TM试剂盒和3130XL遗传分析仪进行等位基因分型。PCR扩增条件按照试剂盒说明书中推荐的反应条件进行。Penta D 基因座上该三联体的等位基因分型见图1。

图1

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	图1 Goldeneye 20A试剂盒复合扩增检测的PentaD基因座基因分型结果

(2)用Promega PP21试剂盒和3130XL遗传分析仪进行等位基因分型。PCR扩增条件按照说明书中推荐的反应条件进行。PentaD基因座上父亲与孩子的等位基因分型见图2。

图2

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	图2 Promega PP21试剂盒复合扩增检测的PentaD基因座基因分型结果

(3)用EX20试剂盒和3130XL遗传分析仪进行等位基因分型。PCR扩增条件按照说明书中推荐的反应条件进行。PentaD基因座上父亲与孩子的等位基因分型见图3。

图3

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	图3 EX20试剂盒复合扩增检测的PentaD基因座基因分型结果

对PCR产物及引物进行测序, 测序结果为:父亲的碱基序列为-[AAAGA]₁₀[AAAGA]₁₁, 母亲的碱基序列为-[AAAGA]₁₀[AAAGA]₁₃, 孩子的碱基序列为[AAAGA]₁₁[AAAGA]₁₃。对引物结合区测序后发现父亲及孩子的反向引物结合区存在点突变(见图4)。

图4

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	图4 3份血样引物结合区碱基序列对比

根据PentaD基因座的序列特性重新设计引物(由苏州阅微基因技术有限公司设计), 引物序列如下:Penta D-F:5’ GAGCAAGACACCATCTCAAGAA 3’ 和Penta D-F:5’ GAAATTTTACATTTATGTTTATGATTCTCT 3’ , 退火温度为60℃, 扩增检测后, 该三联体在Penta D基因座上的等位基因分型见图5。

图5

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	图5 重新设计引物后扩增检测的PentaD基因座上3份血样的基因分型结果

改变退火温度, 用Goldeneye 20A^TM试剂盒和3130XL遗传分析仪对进行等位基因分型。将试剂盒说明书中推荐的PCR反应退火温度60℃降低到58℃, 其余反应条件不变。PentaD基因座上父亲与孩子等位基因分型结果见图6。

图6

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	图6 Goldeneye 20ATM试剂盒改变退火温度后复合扩增检测的PentaD基因座基因分型结果

通过测序发现父亲和孩子在反向引物结合区3'端同一位置存在点突变C→ C/T, 是由父亲遗传给孩子。如果DNA模板的PCR引物结合区发生单碱基突变, 就会阻碍引物的结合, 导致扩增失败, 无法检测到模板DNA中本身存在的一个等位基因^[2], 同样, 点突变也会阻碍引物的结合, 导致该等位基因扩增失败。

没有一对引物可以保证绝对不出现无效等位基因现象^[2]。上述3种试剂盒来自不同厂商, 引物设计不同, Goldeneye 20A^TM试剂盒检测父亲和孩子的基因分型均为纯合子, 存在无效等位基因现象; Promega PP21检测父亲和孩子的基因分型虽然为杂合子, 但杂合子峰极度不均衡, 在STR分析时可能会误删; EX20试剂盒检测父亲和孩子的基因分型为杂合子, 杂合子峰高百分比分别为35%和40%, 在STR分析时应引起高度注意。

降低退火温度重新扩增样本, 会降低引物退火时的保真度^[2]。本实验通过将Goldeneye 20A^TM试剂盒说明中的原有退火温度60℃降低到58℃重新扩增样本, 检测出父亲和孩子的等位基因11, 但是杂合子峰高百分比分别为6%和16%, 因为引物设计并未改变, 没有避开异质区域, 降低退火温度只是降低结合的保真度, 使少量的碱基C结合, 从而检出峰值并不高的等位基因11。

重新设计PCR引物, 避开有问题的碱基位置, 可有效解决无效等位基因现象。本实验中通过避开异质区, 延长引物, 退火温度仍为60℃, 重新检测样本, 父亲和孩子均检出杂合子, 峰高均衡。

如果用同样的引物组合来扩增同一来源的生物样本, 其DNA分型结果应该一致, 所以在个体识别案件中影响应该不大。但是对于亲权鉴定案件中, 如果出现无效等位基因现象, 使争议父亲和孩子某一基因座不符合遗传规律, 往往会认为是突变, 按不符合遗传规律公式计算PI值, 从而降低证据强度。

本文作者认为无效等位基因对STR分型的影响主要在亲权鉴定案件中, 如果遇到亲代与子代在某个基因座上不符合遗传规律, 且基因分型均为纯合子时, 慎重考虑突变, 应通过上述方法进行验证, 从而保证STR分型无误, 保证结果准确可靠。(特别感谢苏州阅微技术有限公司陈春光老师对本研究的帮助和支持!)