引用本文
窦雪丽, 陈红英, 牛蕾蕾, 冯雪玲, 方雅丽. PowerPlex® 16 HS 系统直接扩增法检测肋软骨 [J]. 刑事技术,2014,39(5): 6-8
DOU Xue-li, CHEN Hong-ying, NIU Lei-lei, FENG Xue-ling, FANG Ya-li. Application of direct amplification with PowerPlex®16 HS System for detection of DNA in costal cartilages [J]. Forensic Science and Technology,2014,39(5): 6-8  
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PowerPlex® 16 HS 系统直接扩增法检测肋软骨
窦雪丽1, 陈红英2, 牛蕾蕾3, 冯雪玲1, 方雅丽1
1.广东省汕头市公安局 515011
2.广东省公安厅,广州 510050
3.山西医科大学,太原 030001

作者简介:窦雪丽(1980—),女,山西河曲县人,主检法医师,研究生,主要从事法医遗传学检验鉴定。E-mail:108703466@qq.com

摘要

目的 检验PowerPlex® 16 HS 直接扩增系统对软骨的有效性。方法 采用PowerPlex® 16 HS 复合扩增系统对10例腐败尸体的肋软骨进行直接扩增检验。结果 所检验肋软骨都获得了完整遗传图谱,检测成功率为100%。结论 PowerPlex® 16 HS系统直接扩增法能够应用于肋软骨的DNA分型检验。

关键词: 法医遗传学; 核酸扩增技术; PowerPlex® 16 HS 系统
中图分类号:DF795.2 文献标志码:A 文章编号:1008-3650(2014)05-0006-03
Application of direct amplification with PowerPlex®16 HS System for detection of DNA in costal cartilages
DOU Xue-li, CHEN Hong-ying, NIU Lei-lei, FENG Xue-ling, FANG Ya-li
Abstract

Objective To study the effectiveness of direct amplification with PowerPlex® 16 HS System for DNA detection in costal cartilages.Methods 10 samples of costal cartilage were tested with PowerPlex® 16 HS kit and the results were analyzed statistically.Results whole genetic map of all costal cartilage samples was obtained. Conclusion Direct amplification with PowerPlex® 16 HS system is an effective method for DNA analysis of costal cartilages.

Keyword: forensic genetics; nucleic acid amplification techniques; PowerPlex® 16 HS System

案件侦查具有很强的时效性, 死者身源的DNA鉴定确认往往是命案能及时侦破的重要前提。肋软骨因其相对不易腐败, 易于前处理的特点在腐败尸体的DNA检验中成为首选的生物物证。由软骨细胞、基质及胶原纤维构成的软骨组织结构致密、成分复杂, 在检验时常常需涉及使用相应的裂解液、蛋白酶以释放出游离DNA, 并经提取纯化才能进行STR复合扩增并检测。因此在肋软骨的DNA检验中所需DNA模板提取步骤复杂、耗时。直接扩增法因使用的扩增体系能有效的直接裂解样品并拥有更好的抗PCR抑制物能力, 可省去繁琐的DNA提取纯化步骤, 而在DNA数据库建设中得到广泛的应用。如文献[1]中报道的用直接扩增法检验纸质样本, 文献[2]中报道 DNA 数据库建库中将多种载体人体生物检材用直接扩增法, 文献[3]提到用直接扩增法检测常见检材的DNA等等。目前, 直接扩增法主要适用于血液、唾液类样品, 载体主要为FTA卡、棉签、织物等物质, 而对软骨这类样本未见相关报道。本文通过对肋软骨样品使用PowerPlex○R 16 HS系统经直接扩增法进行DNA检验, 以验证直接扩增法对肋软骨样品的有效性。

1 材料与方法
1.1 实验样本

样本选自本实验室平常受理案件中死亡时间在3天到2周的10例因腐败无法提取心血检材的无名尸体的肋软骨, 所取肋软骨呈轻微腐败, 色泽黄白, 切片透明。

1.2 仪器与试剂

9700 型PCR 扩增仪和3130xl 遗传分析仪购自美国AB 公司, PowerPlex® 16 HS 试剂盒和DNA IQTM纯化试剂盒购自美国Promega 公司。

1.3 方 法

直接扩增法。对10份肋软骨样本分别用洁净手术刀片切取大小约为1.5mm× 1.5mm, 厚度约为0.5mm的软骨薄片1片置干净扩增管底部。向扩增管中加入已预先配制好的PowerPlex® 16 HS扩增体系10μ L, 包括5× Master Mix 2μ L, 10× Primer Pair Mix 1μ L 和ddH2O 7μ L。经离心去除气泡, 并确认软骨薄片在液面以下后按操作手册推荐的扩增条件进行扩增。

对照组检验。将上述10份肋软骨样本分别切取约50mg置于1.5mL离心管内, 采用骨骼孵育液加蛋白酶K对样本进行裂解, 肋软骨消化完全后用DNA IQTM纯化试剂盒对DNA模板提取, 纯化方法按试剂盒操作手册实施。扩增体系和条件按照上述直接扩增法, 但其中模板DNA取1μ L, ddH2O取 6μ L。

STR 检测及数据分析。所有样本的扩增产物在3130xl遗传分析仪上进行电泳, 用Genemapper 3.2对各原始电泳数据进行STR基因分析, RFU≥ 50。

2 结 果

10份肋软骨样本使用直接扩增法均获得了16个基因座的分型结果, 荧光峰相对荧光强度值集中在800至2000RFU之间, 每个样本的各基因座间平衡性较好, 等位基因两个峰面积比值(PAR)大于60%。经与对照组比对, 各样本分型结果一致, 无多带、缺带现象。图1为其中1份尸体肋软骨样本经直接扩增法获得的分型图谱。

图1 肋软骨样本经PowerPlex® 16 HS体系直接扩增法的分型图谱

3 讨 论

肋软骨使用直接扩增法可以加快未知名尸体身源的DNA鉴定。在案件检验实践中, 肋软骨一直是腐败尸体身源DNA鉴定的主要检材。在作者所处的南方沿海地区由于天气潮热、海水浸泡等因素, 大多数尸体腐败较快, 腐败程度较高, 因此位于深层而不易腐败的肋软骨更是实验室中常见物证。此外, 该地区还常常涉及到意外溺水案件, 遇难者亲属的诉求和办案工作需要都要求尽快检验获得结果, 缩短确认死者身源的时间。肋软骨中细胞包埋在基质和胶原纤维之中, 其中含有多种PCR抑制物成分, 目前通常采用商品化试剂盒、硅珠法或Chelex 法提取, 这些方法都要经过相应的裂解、提取、纯化过程。直接扩增法省略了以往常规方法中样本裂解和DNA提取纯化的复杂步骤, 让检材直接参与扩增, 有效的减少了中间环节, 节约了时间。本实验使用的PowerPlex® 16 HS 系统直接扩增方法和DNA IQTM磁珠方法相比节省了6h~10h, 极大的缩短了结果获得时间, 使案件能及时获得死者身源信息。

直接扩增方法由于没有裂解、提取、纯化步骤, 其优点不仅仅是节省时间, 还有以下优点。一是简化操作、节约成本。应用常规提取纯化方法和荧光复合扩增检测试剂盒进行样本检测需要获得一定质量的DNA模板, 往往涉及一系列商品化试剂和耗材, 全部过程需耗费大量的人力、物力、财力, 而直接扩增方法避免了这些成本消耗。二是有效地避免污染。在实验中步骤越多, 使用的耗材越多, 引入污染的可能性就越大。直接扩增法有效的避免了样本裂解、提取、纯化的每个步骤中样品间、器具耗材与样品间污染的潜在风险, 更加保证了结果的可靠性。

本实验证明使用PowerPlex® 16 HS体系直接扩增法能很好应用于肋软骨样品。PowerPlex○R 16 HS系统比常规PowerPlex○R 16试剂盒具有更强的抗抑制能力[4], 能够在免除DNA提取与定量的步骤的基础上, 实现肋软骨等样本STR分型结果的直接获取。与常规PowerPlex® 16试剂系统相比, 直接扩增系统简化了操作流程, 能极大的提高工作效率, 节约办案经费, 减少人力物力的投入。生物样品中通常含有可以抑制DNA扩增的物质[5, 6], 为了克服PCR抑制, PowerPlex® 16 HS试剂盒经过改进缓冲液配方使之获得更有效的释放DNA和更好的抗抑制物能力。PowerPlex® 16 HS试剂盒对法医样品中一些常见的抑制物如血色素、腐殖酸和单宁酸等具有很好的抗抑制效果[7], 其使用直接扩增法对新鲜血样、口腔拭子、烟蒂样本和10年以上的陈旧血卡等均能有效检验[3, 8, 9]。通过实验显示, 肋软骨这样通常认为较难裂解和成分复杂的样品, 采用PowerPlex® 16 HS试剂盒直接扩增法也能获得良好的基因座分型, 并且在整体峰值高度, 基因座内杂合子平衡性, 同一荧光染料通道的各峰值高度平衡性方面均有不错表现。采用直接扩增法时, 扩增体系的多少与起始的样品量有一定的相关性, 文献[9]研究显示1.2mm直径的血片在25μ L扩增体系中结果良好, 而在10μ L扩增体系中表现出PCR抑制。而作者在实践中发现对于肋软骨的直接扩增时, 10μ L扩增体系中肋软骨用量为大小约1.5mm× 1.5 mm, 厚度约0.5mm的软骨薄片1片时, 检验效果较为理想。但是由于不同样本间存在差异(如腐败程度不同), 各实验室仪器灵敏度和参数设置不同, 因此不同的实验室还需要根据实际情况进行调整, 以增加直接扩增的成功率。需要特别注意的是, 在电泳前加样时应小心操作, 切不可吸入检样载体, 以免堵塞电泳仪毛细管。

综上所述, 本实验论证了使用PowerPlex® 16 HS 试剂盒对肋软骨样本直接扩增并进行STR 分析的有效性。该方法简单快速、高效稳定、防止污染、节约成本, 检材需求量小, 适用于日常检案分析和DNA 数据库建设。在下一步实验中, 将对GlobalFilerTM Kit和PowerPlex® Fusion等试剂盒进行实验验证。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
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[4] R. McLaren. PowerPlex® 16 versus Identifiler-Systems-Sensitivity and Effects of Inhibitors[EB/OL]. (2007-12-07)[2009-12-15]. http://www.promega.com/appnotes/an156/an156.pdf. [本文引用:]
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[8] M G Ensenberger, J Thompson, B Hill, et al. Developmental validation of the PowerPlex® 16 HS System: An improved 16-locus fluorescent STR multiplex[J]. Forensic Sci Int Genet, 2010, 4(4): 257-64. [本文引用:1]
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