引用本文
余建华, 黄磊, 苏世达, 范豫杰, 向超杰, 李安, 程宝文, 翟滇, 李万水, 徐秀兰, 涂政, 萧称海, 黄仁武. 粘取法、直接扩增法联合应用DNA分型3例[J]. 刑事技术,2014,39(5): 53-55
[J]. Forensic Science and Technology,2014,39(5): 53-55  
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粘取法、直接扩增法联合应用DNA分型3例
余建华1, 黄磊1, 苏世达1, 范豫杰1, 向超杰1, 李安1, 程宝文2, 翟滇2, 李万水3, 徐秀兰3, 涂政3, 萧称海4, 黄仁武4
1.云南省昆明市公安局刑事科学技术研究所,650233
2.云南省公安厅刑事科学技术研究所,昆明 650032
3.公安部物证鉴定中心,北京 100038
4.云南大腾生物科技有限公司,昆明 650000
摘要
关键词: 粘取法; 直接扩增法; DNA; 微量生物物证
中图分类号:DF795.2 文献标志码:B 文章编号:1008-3650(2014)05-0053-03

随着DNA分析技术在的法医领域的研究和广泛应用, DNA检验的对象已从常规检材拓展到不易被发现而常被忽略的微量检材, 如作案工具把手上、衣帽鞋袜上粘附的上皮细胞等目前已成为重要的物证来源[1]。现场微量生物物证一旦获得有价值的DNA分型, 在侦破、诉讼中就能发挥重大作用。如何提高微量生物物证的检出率、准确度、时效性, 使得许多现场潜在的生物物证在侦查破案中能够发挥应有的价值, 就显得愈来愈重要。

本文联合应用粘取法、直接扩增法检验微量生物物证, 可获得满意的单一DNA分型, 该检验方法简捷、适用、可靠, 为微量生物物证的检验提供了一种切实可行的方法。

1 方 法
1.1 取 样

将已提取过微量生物物证的粘取器粘面用洁净的刀片切成纵横交错小胶片(如图1), 每片2mm× 2mm大小, 用镊子转移1片到200μ L PCR反应管的底部, 或者将未提取过的粘取器粘面切分成2mm× 2mm大小, 用镊子取1片与物证表面轻轻接触粘取, 将胶皮转移到200μ L PCR反应管的底部。

图1 粘取器-胶片

一般每片胶片只在物证对应的胶片大小范围(2mm× 2mm) 内粘取, 每个部位同法同步取样3~5个, 平行检验。

1.2 扩 增

在每个装有胶片的PCR反应管中使用Powerplex 21试剂盒进行扩增, 扩增体系为10μ L, 反应参数为:96℃× 1min× 1循环、94℃× 10s /59℃× 1min/72℃× 30sec× 30循环、60℃× 20min。

1.3 检 验

取1.0μ L扩增产物加入含有10μ L上样液(10μ L甲酰胺中加0.2μ L CCS ILS500分子量内标)中, 在3500XL型遗传分析仪上进行电泳, 用GeneMapperID-X对各原始电泳数据进行STR基因分型及统计分析。

1.4 结 果

3个案例中, 除案例2刀柄上获得混合DNA分型外, 其余物证各样本均获得单一个体的DNA分型。以案例1检验结果(见表1)为例, 4个部位12份样本检出的DNA基因座数量为15~21个, 基因座检出率为71.4%~100%, 检出的等位基因数为22~34个, 等位基因检出率64.7%~100%, 峰高为500~3500RFU, 已达到同一认定水平。

2 案例应用

案例1 某年盗窃电缆线系列案中, 用上述方法检验作案运输工具汽车的方向盘、排挡杆、手刹柄、驾驶室门内侧拉手等4个部位, 每个部位同步检验3份, 共12份样本。结果均获得同一男性个体的DNA分型, 而且与犯罪嫌疑人比对均一致。具体检验结果见表1及图2。

表1 案例1检验结果

图2 案例1车门拉手上检出的DNA分型图谱

案例2 某年发生一起劫持人质案。从犯罪嫌疑人手中缴获劫持人质所用的刀一把, 刀刃、刀柄血痕预实验、种属实验均为阴性。用上述方法检验, 刀刃上检出的DNA分型(见图3)与人质(见图5)一致, 从该刀刀柄上获得混合DNA分型(见图4), 包含犯罪嫌疑人、人质的DNA分型(见图5, 图6)。

图3 案例2刀刃上检出的DNA分型图谱

图4 案例2刀柄上检出的DNA分型图谱

图5 案例2人质的DNA分型图谱

图6 案例2吸毒男子的DNA分型图谱

案例3 某年一起暴恐案件中, 应用上述方法, 从嫌疑人住所提取的物证上(衣物、电子产品)、现场物证上获得的DNA分型分别与犯罪嫌疑人一致(见图7~图11)。

图7 案例3住所现场物证1检出的DNA分型:A

图8 案例3住所现场物证2检出的DNA分型: B

图9 案例3暴恐现场物证1检出的DNA分型:C

图10 案例3暴恐现场物证2检出的DNA分型:D

图11 案例3住所现场物证3检出的DNA分型:E

3 讨 论

在日常DNA检案中, 检验过程一般包括DNA的提取、扩增、检验三步骤, 而提取方法中除chelex-100方法操作相对简单外, 其他方法需结合纯化、浓缩等步骤, 涉及取样、离心、孵育、解离等环节, 步骤多、操作时间长, DNA易耗损, 存在交叉污染的可能。直接扩增法无需提取步骤, 加入扩增试剂后直接扩增, 是一种快速得到DNA分型的简便方法[2]。目前直接扩增方法在DNA数据库建库批量样本[2]、现场常规检材(包括血迹、烟蒂)[3]、微量生物检材(牙刷、饮料瓶、指甲附着物)[4]等方面已有应用。

微量生物检材上粘附的脱落细胞数量有限, 使得PCR抑制因素更加突出, 因此在提取微量生物检材上脱落细胞时应尽量多收集, 需要反复擦拭, 有利于提高检出率[4]。实际检案中, 采用反复擦拭、较大面积内擦拭提取微量检材, 有利于获得足够检验量的细胞, 从而提高检出率, 但是这样操作很容易带来污染和抑制物, 表现为检验结果大多获得混合DNA分型、检出基因座较少、丢峰现象突出、无阳性扩增产物等。物证污染是影响物证鉴定结果的重要因素之一, 从现场到实验室是多环节的链状关系, 各环节都有发生污染的可能[5]。实验室内物证提取时发生的污染多导致检出混合分型, 原因可能二种:一是擦拭面积较大, 而使得单一面积内原本为单一个体的细胞, 而混入其他个体的细胞; 二是因反复擦拭, 除提取到物证表面浅层易脱落细胞外, 还提取到粘附时间较长、不容易脱落的细胞而出现混杂现象。

另外, 混合DNA分型中DNA来源个体数不确定、优势扩增、DNA分型不准确等原因, 使得结果的分析变得很复杂, 即使经过人工或软件拆分、组合, 在个案比对、入库查比中等应用中也还存在比对不充分、比对结果准确性不高、无法对混合DNA中个体的来源进行认定等问题, 所以, 相对于单一个体的DNA分型而言, 混合DNA分型应用的复杂度和难度极大, 在排查和认定犯罪嫌疑人存在诸多不确定因素, 实际应用价值不高。

本文采用小面积胶片粘取法同步提取多份样本, 再应用直接扩增法平行扩增、检验微量生物物证, 根据多份样本DNA检验结果综合分析, 如按照2/3或3/5原则来确定结果, 方法简捷步骤少、操作简单, 除节省了大量的检验时间、提高检出率和准确性外, 还可获得单一DNA分型, 直接用于认定和串并, 从而提升了微量生物物证的实际应用效能, 较好的满足了微量生物物证DNA检验在基因座检出的数量与质量(峰高、峰面积)等方面的实际检案要求。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
[1] 陈松, 李万水, 胡兰, 等. 微量生物物证: 容易忽略的生物物证[J]. 刑事技术, 2004(6): 19-22. [本文引用:1]
[2] 李安, 向超杰, 余建华, 等. 多种载体人体生物检材直扩方法在DNA数据库建库中的实验研究[J]. 昆明医学院学报, 2011(7): 47-51. [本文引用:2]
[3] 张艳霞, 李爱强, 赵丽, 等. 直接扩增法用于常见现场检材DNA检验[J]. 中国法医学杂志, 2012, 27(1): 62-63. [本文引用:1]
[4] 冯燕. 直接扩增法检验微量生物检材DNA在刑事案件中的应用[C]. 法医遗传学应用与展望——第四届全国法医DNA检验技术研讨会暨2012法医遗传学新进展国际研讨会论文选[A]. 北京: 中国人民公安大学出版社, 2012: 151-152. [本文引用:2]
[5] 马原, 裴黎, 涂政, 等. 带血手套腕部微量上皮细胞DNA检验1例[J]. 法医学杂志, 2006, 22(06): 470-471. [本文引用:1]