UV-2450型紫外可见分光光度计(日本, 岛津公司), 附反射附件ISR-240A积分球, BaSO4标准参比粉末。波长范围:200nm~750nm; 中速扫描; 采样间隔:0.5; 狭缝宽:1.0nm; 光源转换波长:360nm。

1.2.1 血痕纱布准备 用取血针取健康人耳血0.1mL均匀涂于10.0cm× 6.0cm的单层医用纱布上, 获得原始血纱布。剪取血纱布4.0cm× 5.0cm(编号为人血Ⅰ ), 剪取4.0cm× 5.0cm空白纱布若干块, 按着1/2倍的方法用生理盐水稀释原始血纱布上的血迹, 依次获得更低血痕浓度纱布, 最低血痕浓度4.0cm× 5.0cm大小纱布涂有0.1/96mL(约1μ L)血液, 分别编号为Ⅱ 、Ⅲ 、Ⅳ 、Ⅴ 、Ⅵ 。

其他动物血迹均采取各0.1mL均匀涂于10.0cm× 6.0cm的单层纱布上, 剪取1/3大小血纱布备检。

以上纱布均室温自然干燥后供检验。

1.2.2 其他检材采取 分别取腐败鲅鱼腹腔内液体、 腐乳汁各0.1mL, 分别均匀涂于10.0cm× 6.0cm单层医用纱布上自然干燥, 备检。

称取一定量的BaSO4粉末(不少于1.000g)放入样品池中, 然后用有机玻璃柞将表而压平。首先在积分球中样品光束和参比光束中分别插入BaSO4标准白板, 调整基线, 然后分别以BaSO4标准白板作参比, 将带检材纱布样本板插入积分球样品光束, 扫描反射光谱。

按照试验设定的条件, 对同一浓度鸡血血痕不同纱布进行测试, 3次测量结果的重现性如图1。

图1

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	图1 鸡血血痕的重现性结果

血痕浓度对波峰波谷位置没有影响。图2是人血痕单层纱布, 3种浓度的反射光谱, Ⅰ 为原始浓度, 0.033mL, Ⅱ 为浓度0.016mL, Ⅵ 为0.001ml(1μ l)。3个曲线波形有差异, 但波峰波谷位置完全一致。波峰有4个, 分别在563nm、502nm、303nm、248nm; 波谷有5个, 分别在576nm、540nm、412nm、281nm、222nm, 尤其在412nm处的波谷非常明显。

图2

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	图2 不同浓度人血痕纱布紫外可见反射光谱

不同种属血痕紫外可见反射光谱峰的位置、峰的数量一致(见图3)。人血、鸡血、羊血痕迹在200nm~400nm区域内均可见两个反射波峰, 分别在248nm、303nm, 两个波谷, 分别在222nm、281nm; 在400nm~750nm区域均可见两个反射波峰, 分别在502nm、563nm处, 3个波谷, 分别在412nm、540nm与576nm处。

图3

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	图3 几种血痕紫外可见反射光谱

几种不同物质紫外可见反射光谱不同。颜色相似的血痕、腐乳斑和腐败暗红的鱼腹腔液体斑的紫外可见反射光谱有明显区别(见图4)。腐败的鲅鱼腹腔内的液体在236nm、305nm处各有一个反射波峰, 在264nm、404nm处各有一个波谷; 腐乳汁在465nm、368nm处各有一个反射波峰, 在270nm、423nm、499nm处各有一个波谷。

图4

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	图4 几种样本紫外可见反射光谱

2.2.1 重现性分析 分别选取746nm、644nm、412nm、306nm、220nm、710nm、617nm、570nm、417nm处的反射率进行统计分析。分别比较3次试验中的两条谱线的反射率, 方差分别为0.806154、2.784009、1.4225。t值分别为0.46221、1.29115、1.45833, 均小于3.3554, 结果显示3次试验结果不存在显著性差异, 重现性良好。

2.2.2 血痕浓度不影响波位、波峰波谷数目 不同浓度血痕纱布的紫外可见反射光谱反射率不同, 但波位、波峰波谷数目一致。并且不同于其他非血痕样品的紫外可见反射光谱。与辛玉军等人的研究结果相互印证, 研究血清紫外可见吸收光谱发现, 416nm处吸收峰有红细胞的贡献, 280nm处的吸收峰为蛋白质芳香族氨基酸色氨酸、酪氨酸的苯杂环特征, 在252nm处有一个波谷。血红蛋白吸收峰在555nm处, 氧合血红蛋白吸收峰在579nm和542nm处, 碳氧血红蛋白最大吸收峰在572nm和539nm处。谢济运等利用光谱仪研究发现, 全血、红细胞在417.6nm、540nm、575nm处有明显吸收峰, 血清在278.5nm处有吸收峰, 溶血后417.6nm吸收峰蓝移至413nm处^[2]。

本研究的结果表明, 紫外可见反射光谱法结果中反射光谱的波谷处, 即波谷576nm、540nm、412nm、281nm处, 与在紫外可见吸收光谱法研究检测血液吸光度的实验中吸收光谱的峰值, 非常接近。波位有1nm~6nm的差异。图1中不同浓度血痕峰形不完全一致也证明了多组分反射光谱的波峰与浓度不呈直线关系, 可以根据库贝卡一芒克函数(K-M函数), 利用PCR主成分回归建模法推导一定条件下的关系。

2.2.3 波峰与波谷的位置是血痕确证的依据 人血与动物血紫外可见反射光谱在波峰波谷的位置上完全一致, 都能反映出血痕特征反射光谱, 这应该是利用紫外可见反射光谱法确定血痕的依据。原因是, 血红蛋白是生物界最为保守的一种蛋白质, 人、猪、牛等血红蛋白的氨基酸序列有85%是一致的, 相似性达到95%以上, 同时其空间结构相似性也很高, 具有非常相似的三维结构, 所以虽然血痕来源于不同种属, 但是其血红蛋白及其衍生物的吸收光谱完全一致^[3], 也就是说它们的反射光谱也完全一致。徐文豪等的研究也证明鸡血血红蛋白与人血血红蛋白紫外可见吸收光谱趋势一致^[4]。

几种颜色类似, 结构不同物质, 紫外可见反射光谱存在明显差异, 这些差异不但反映在峰形上, 更反映在峰位本质上的差异, 腐败鲅鱼腹腔内液体在503nm处有一个反射峰, 而血痕在此处也有一个反射峰, 推测可能与其中都含有某种基团有关, 至于具体的成分还需进一步实验。

综上所述, 利用紫外可见分光光度计反射光谱可以无损、快速确定疑似血痕, 本实验检出限量是1μ L, 是一种灵敏度较高且非常实用的方法。但是, 能否利用紫外可见分光光度计反射光谱法进一步发现人血与动物血的微小差异以及新旧血痕的差异, 还需要进一步实验。