引用本文
赵伟, 于子辉, 王静, 叶健, 唐晖. 保存温度及保存时间对AmpFlSTR® Identifiler® PlusKit PCR Reagents试剂盒PCR混合液效能影响的研究 [J]. 刑事技术,2014,39(5): 24-26
ZHAO Wei, YU Zi-hui, WANG Jing, YE Jian, TANG Hui. A study on performance of AmpFlSTR® Identifiler® Plus Kit PCR Reagents kit PCR mixture stored in different storage time and temperature [J]. Forensic Science and Technology,2014,39(5): 24-26  
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保存温度及保存时间对AmpFlSTR® Identifiler® PlusKit PCR Reagents试剂盒PCR混合液效能影响的研究
赵伟1, 于子辉1, 王静1, 叶健2, 唐晖1
1.北京市公安局刑事侦查总队 100192
2.公安部物证鉴定中心 法医遗传学公安部重点实验室,北京 100038

作者简介:赵 伟(1978—),男,内蒙古赤峰市人,主检法医师,本科,主要从事DNA检验。Tel:13522769105

摘要

目的 探讨AmpFlSTR® Identifiler® Plus Kit PCR Reagents混合液使用时间和温度的影响因素。方法 试剂盒PCR混合液依次在4℃、室温、-20℃下保存1周、2周至15周不等,用于样品STR分型检验。结果4℃保存的PCR混合液在15周之内可以检验出标准品9947A的STR分型;室温保存在6周之内可以检出;-20℃保存至少在15周内可以检出。结论 由AmpFlSTR○R Identifiler○R Plus Kit PCR Reagents试剂盒各组分组成的试剂盒PCR混合液在一定的保存条件下使用是可行的,符合法庭科学人类荧光标记STR技术要求。

关键词: DNA 检验; 试剂盒; 保存条件
中图分类号:DF795.2 文献标志码:A 文章编号:1008-3650(2014)05-0024-03
A study on performance of AmpFlSTR® Identifiler® Plus Kit PCR Reagents kit PCR mixture stored in different storage time and temperature
ZHAO Wei, YU Zi-hui, WANG Jing, YE Jian, TANG Hui
Abstract

Objective To study the DNA test availability of AmpFlSTR Identifiler® Plus Kit PCR Reagents kit PCR mixture stored in different storage time and temperature. Methods Control DNA 9947A was amiplified with PCR mixtures which were stored at 4℃, room temperature, -20℃ for 1week, 2weeks till 15weeks respectively. Results with the PCR mixtures stored at three storage conditions (4℃ for 15 weeks, room temperature for 6 weeks and -20℃ for 15 weeks), control DNA 9947A could be genotyped successfully. Conclusions AmpFlSTR® Identifiler® Plus Kit PCR Reagents can be stored at certain storage conditions and this is in accordance with the technical requirements of human forensic STR.test.

Keyword: DNA test; Kit; storage condition

在法医物证专业研究领域中, 特别是在检验各类检材的过程中都会用到各类试剂盒, 其中包括进口AmpFlSTR® Identifiler® Plus Kit PCR Reagents (AB)等和国产的20A(基点认知)等试剂盒。各种试剂盒都会标记各组分的有效期, 但是都没有就PCR反应混合液的保存温度和保存时间作出具体标明, 这对PCR混合液的合理化使用带来了一定的不确定性。提前混合扩增试剂盒各组分的做法虽未得到生产商的推荐和验证而成为作业指导书的标准方法, 但在配置PCR混合液的过程中, 往往剩余PCR混合液, 主要表现在实验室DNA检验人员扩增时剩余的PCR混合液到底是否可以继续使用, 尤其是DNA数据库建设中, 工作人员每次多配置的PCR混合液在什么样的条件下保存多长时间可以使用等问题。针对这一系列问题, 为了节约办案成本, 在排除潜在污染的前提下, 本文从保存温度和保存时间两方面对AmpFlSTR® Identifiler® Plus Kit PCR Reagents试剂盒PCR混合液的影响做出探究。

本文的研究目的是对AmpFlSTR® Identifiler® Plus Kit PCR Reagents试剂盒PCR混合液保存温度和保存时间做出有效性的评估, 得到公安工作中侦查办案所需要的鉴定条件。通过对PCR混合液在不同保存温度下的保存时间摸索, 总结出AmpFlSTR® Identifiler® Plus Kit PCR Reagents试剂盒在实际使用中的最大效能。

1 材料与方法
1.1 实验试剂

AmpFlSTR® Identifiler® Plus Kit PCR Reagents试剂盒PCR混合液(混合液组成包含AmpFlSTR® Identifiler® Plus Master Mix、AmpFlSTR® Identifiler® Plus Primer Set、SdH2O); Control DNA(以上试剂均购自美国应用生物系统公司)(9947A浓度为1ng/μ L); AmpFlSTR® Identifiler® Plus Kit Allelic Ladder(50μ L/管); GeneScanTM-500 LIZ® SIZ Standard内标(250μ L/管)。

1.2 方 法

1.2.1 保存温度选择 根据法医实际工作情况, 本文选取4℃、室温环境、-20℃3个常见保存温度。4℃、-20℃为法庭科学标准实验室冰箱标配, 室温控制在22℃~28℃之间。

1.2.2 保存时间选择 以周为单位, 依次在4℃、室温、-20℃下保存1周、2周、3周、4周等为保存单位进行STR分型检验。

1.2.3 PCR扩增及产物检测 以24μ L PCR混合液为载体, 加入标准9947A模板1ng, 25μ L体系进行扩增和基因型检测, 热循环反应按试剂盒说明书进行。扩增产物用3130xl型基因分析仪进行分型检测。本次试验的等位基因分型标准是基于AB公司对常规检材与疑难检材的分型差异, 本试验所用模板为9947A, 峰值在200RFU以上判断为有效分型。

2 结 果

针对AmpFlSTR® Identifiler® Plus Kit PCR Reagents试剂盒PCR混合液, 在4℃保存15周时, 检验图谱见图1。

图1 4℃保存15周得到的检验结果(圆圈处为非特异性分型)

针对AmpFlSTR® Identifiler® Plus Kit PCR Reagents试剂盒PCR混合液, 在室温情况保存时间6周时结果, 见图2。

图2 常温保存6周的检验结果

针对AmpFlSTR® Identifiler® Plus Kit PCR Reagents试剂盒PCR混合液, 在-20℃保存时间15周时, 结果见图3。

图3 -20℃保存15周的检验结果

本次试验样本均用9947A, 每次试验重复数2次, 在4℃、室温、-20℃保存条件下, 最长的检验时间分别为15周、6周、15周。

3 讨 论

实验结果显示, 本实验采用的是标准9947A模板DNA, 其分型峰值随着保存时间的推移而降低, 这符合等位基因分型标准物、PCR缓冲液、荧光标记物对等位基因峰型的影响[1] 。

4℃条件下, 保存15周, 得到分型结果如图1所示, 在FGA基因座出现了3个峰, 由于已知9947A在该基因座的分型结果, 可以明确断定该基因座出现的第1个峰型为offladder[2], 通常在图谱分析中叫做基线跳跃或摆动, 通常是被删掉的。在通常的法医亲子鉴定中[3], 在该试剂盒FGA基因座检测失败情况下, 明确在FGA基因座上存在分型差异, 无法明确判断其真正分型, 此图谱通常不被采纳用于亲缘关系鉴定。

室温条件下, 保存6周得到分型结果(见图2), 在D19S433、vWA、TPOX、D18S51这4个基因座分型峰值出现了接近和低于200RFU的情况, 且在6周以后做出的分型以上4个基因座峰值都在200RFU以下, 另外TH01基因座两个峰高之比为45%, 明显在70%以下, 这就表明第6周的检验结果为无效分型[4]。

-20℃条件下, 保存15周, 得到分型结果如图3所示, 各基因座均衡性、稳定性均符合中华人民共和国公共安全行业标准[4], 但本次实验结果不是最终临界点, 在今后的研究中将继续检测-20℃保存的PCR混合液情况, 至少延长到一年时间左右。根据平时检案的经验, 低温保存试剂盒对于荧光标记物[1]的荧光消散起到了很好的抑制作用, 实验结果也印证了低温保存PCR混合液对结果的影响。

本研究所用商品化试剂盒中各种组分都有其固定的保存条件, 混合在一起组成的PCR混合液理论上是相对不稳定体系, 有可能发生聚合酶链式反应[5]的启动, 这种反应的提前启动诱发了引物的非特异结合, 随着时间的延长引物的荧光也会消散。本研究表明由AmpFlSTR® Identifiler® Plus Kit PCR Reagents试剂盒各组分组成的PCR混合液在一定的保存条件下使用是可行的。

研究结果表明AmpFlSTR® Identifiler® Plus Kit的PCR反应液在4℃保存情况下, 至多保存15周; 在室温保存情况下, 至多保存6周; 在-20℃保存情况下, 至少能检测到15周有效; 以上研究结果必须在正常的检验环境下, 排除潜在污染等因素, 才可能得到9947A的满意结果。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
[1] 侯一平, 李成涛, 等(译). 法医DNA分型专论: 方法学[M]. 北京: 科学出版社, 2013: 90-108. [本文引用:2]
[2] 侯一平, 王保捷, 郭大玮. 法医物证学[M]. 北京: 人民卫生出版社, 2010: 136-137. [本文引用:1]
[3] 唐晖, 焦章平等(译). 法庭科学DNA证据的解释[M]. 北京: 科学出版社, 2010: 9-10. [本文引用:1]
[4] 中华人民共和国公安部. GA815-2009 法庭科学人类荧光标记STR复合扩增检测试剂质量基本要求[S]. 北京: 中国标准出版社, 2009. [本文引用:2]
[5] 孙乃恩, 孙东旭, 朱德煦. 分子生物学[M]. 南京: 南京大学出版社, 2004: 84-119. [本文引用:1]