引用本文
杨敏, 张玉红, 韩海军. 国产NuHi-POP4与ABI POP-4在毛细管电泳分离效果的比较[J]. 刑事技术,2014,39(5): 18-21
YANG Min, ZHANG Yu-hong, HAN Hai-jun. Comparison of NuHi-POP4 and ABI POP-4 in the forensic applications[J]. Forensic Science and Technology,2014,39(5): 18-21  
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国产NuHi-POP4与ABI POP-4在毛细管电泳分离效果的比较
杨敏1,2, 张玉红2, 韩海军2
1.复旦大学生命科学学院,上海市 200433
2.江苏省南通市公安局刑警支队,226007

作者简介:杨 敏(1984—),女,江苏如皋人,法医师,在职研究生,从事法医DNA检验研究。Tel:13390960639,E-mail:yangmier1207@163.com

摘要

目的 比较国产基因分离胶NuHi-POP4与美国产商品ABI POP-4在法医鉴定应用中的分离性能。方法 以国产基因分离胶NuHi-POP4和美国产的ABI POP-4为研究对象,分别考察其在毛细管电泳过程中对标准品LIZ500和实际样品的分离效果,并统计其电泳参数,包括电泳时间、电流、单碱基分辨率以及线性关系等,从而来比较两种胶的分离性能,评价其性能。结果 NuHi-POP4与ABI POP-4相比,不仅可以显著缩短内标和样品的分析时间,同时还表现出电流稳定、分辨率高、线性关系好等特点。结论 国产NuHi-POP4与美国ABI POP-4相比,同样具有稳定、快速、高分辨等优势,结果准确可靠。

关键词: 基因分离胶; NuHi-POP4; ABI POP-4; 毛细管电泳; 法医物证
中图分类号:DF795.2 文献标志码:A 文章编号:1008-3650(2014)05-0018-04
Comparison of NuHi-POP4 and ABI POP-4 in the forensic applications
YANG Min, ZHANG Yu-hong, HAN Hai-jun
Abstract

Objective To compare the separation performance of domestic gene separation gel NuHi-POP 4 and American products ABI POP- 4 in forensic applications. Methods LIZ 500 standards and blood samples collected in cases were analyzed by using NuHi-POP 4 and ABI POP- 4 respectively, and the electrophoretic parameters, including electrophoresis time, current, single base resolution and linear relationship were compared. Results With NuHi-POP 4, electrophoresis time was shorter; also we got stable current, high resolution, good linear relationship. Conclusions performance of NuHi-POP 4 gene separation gel was as good as that of ABI POP- 4.

Keyword: gene separation gel; NuHi-POP 4; ABI POP- 4; capillary electrophoresis; forensic science

毛细管电泳(capillary electrophoresis, CE), 又称高效毛细管电泳(high performance capillary electrophoresis), 是泛指在极细的毛细管(直径约20μ m~100μ m)内实现的一大类电泳技术, 其自19世纪80年代初创立以来, 已成为近20年发展最快的分离分析技术之一[1]。它综合了高效液相色谱和传统平板凝胶电泳二者的优点, 具有快速、高效、高分辨率、重复性好、易于自动化等特点, 已广泛应用于医学、生物学、生命科学等多个领域[2, 3, 4]。用于分离DNA片断的毛细管电泳方法主要有毛细管凝胶电泳和无胶筛分毛细管电泳, 无胶筛分毛细管电泳技术在DNA片段的分离和测序方面的应用频繁[5, 6]。

目前, 在法医鉴定中应用最广泛的筛分介质主要是美国ABI公司生产的POP-4基因分离胶。近年来, 国内一些企业开始致力于国产胶的研究, 旨在研究出高性能低价格的分离胶。本文通过遗传分析仪分别使用国产NuHi-POP4与美国产的ABI POP-4, 分别考察标准品LIZ500和实际样品的分离情况, 在电泳时间、电流、单碱基分辨率以及线性关系等方面作比较, 评价其性能。

1 材料与方法
1.1 材 料

仪器:9700型扩增仪、3130XL遗传分析仪(ABI公司)。

试剂:AmpFlSTR Identifiler Plus扩增试剂盒及扩增后试剂盒(ABI公司)、甲酰胺HD(ABI公司)、ABI POP-4胶(ABI公司)、NuHi-POP4胶(苏州新海生物科技有限公司)。

实验中采用的标准品为分子量GS500LIZ (ABI公司), 样本为实验室日常案件中积累的血样384份, 经硅珠法[7]提取, 按照AmpFlSTR Identifiler Plus扩增试剂盒(ABI公司)使用说明, 放置于9700型扩增仪按照标准扩增, 得到扩增产物。

1.2 方 法

1.2.1 标准品LIZ500分析测试 每1mL的HD中加入15μ L的LIZ500, 混匀, 96孔板每孔加入15μ L混合物, 更换新配制稀释10倍的电泳缓冲液(ABI公司), 进行电泳, 检测384份。

1.2.2 样品测试 法医物证样本为上述LIZ500标准品15μ L电泳体系中, 加入1μ L扩增产物, 检测384份。将3130XL遗传分析仪先灌入ABI POP-4对上述样本进行电泳, 电泳结束后, 清洗毛细管, 灌入NuHi-POP4, 重复步骤1.2.1和1.2.2。本文实验条件与ABI公司推荐的实验条件一致。

1.2.3 数据的收集与分组 用数据分析软件GeneMapper ID-X采集ABI POP-4组和NuHi-POP4组的数据。

2 结 果
2.1 标准品LIZ500测试结果

2.1.1 分析时间 使用ABI POP-4与NuHi-POP4各检测LIZ500样本384份, LIZ500片段的出峰数据收集点分别见图1和图2。分别选择75、100、139、150、160、200、300、340、350、400、450、490、500片段的出峰数据收集点各设9组, 以各片段与75bp出峰数据收集点的差除以各片段与75bp大小的差得到单碱基对(1bp)相对迁移时间[8]。取384份样本的平均数, 得到以下数据(见表1)。

2.1.2 单碱基分辨 单碱基分辨率是:

R=2× (T2-T1)/1.699/(W(1/2)1+W(1/2)2)/(N2-N1), 其中T2、T1为两种片段的迁移时间, W(1/2)1、W(1/2)2为片段的半峰宽, N2、N1为片段大小[9]。应用此公式计算出LIZ500片段的单碱基分辨率, 并经统计学处理, 取384份样本的平均数, 得到以下数据(见图3)。

图1 ABI POP-4的LIZ500测试图谱

图2 NuHi-POP4的LIZ500测试图谱

表1 样本数据处理示例

2.1.3 线性关系 通过对384份样本的片段与出峰时间的关系, 分别取每个片段出峰数据收集点的平均值, 得到以下图谱(见图4, 图5)。

2.2 样本分型结果(见表2)

图3 NuHi-POP4与ABI POP-4分辨率比较

图4 NuHi-POP4与ABI POP-4线性关系比较

图5 ABI POP-4的电流局部图

图6 NuHi-POP的电流局部图

表2 样本检验结果

经统计比对, 本实验中NuHi-POP4与ABI POP-4二者分别检测的384份样品, 检出数相同且分型结果一致。

3 讨 论

本实验使用了同一台测序仪, 并抽取同一道毛细管的实验对象进行贴图比较研究, 最大程度的降低外在等其他干扰因素的影响。在具体分析时, 由于普通生物检材样本易受多种因素的影响, 导致分型随之有所变化, 不利于分析比对。本实验主要针对LIZ500进行测试研究, 直接反映不同大小的DNA片段在电泳中的分离度, 评价毛细管电泳系统效能。

在两组LIZ500对比实验中, 使用ABI POP-4时, 384份样本的片段75的出峰数据收集点在3288~3454之间, 片段500的出峰数据收集点在9315~9658之间, 整个分析数据收集点在6007~6359之间, 平均分析数据收集点为6178。而使用NuHi-POP4时, 384份样本的75bp的出峰数据收集点在1810~1872之间, 片段500的出峰数据收集点在6106~6315之间; 整个分析数据收集点在4262~4359之间, 平均分析数据收集点为4322。两者对比, 使用NuHi-POP4, 整个分析时间缩短了约30.0%。基于每批次间电泳条件微小变化也可能影响初始电泳迁移时间, 而使75bp的出峰数据收集点在批次间偏差较大, 但各大片段与75bp的出峰数据收集点相对稳定, 不会影响到批次内以75bp出峰数据收集点为参照计算迁移时间。经统计, ABI POP-4的平均迁移时间约为15.20, NuHi-POP4的为10.56, 比ABI POP-4的迁移时间缩短了约30.30%。

NuHi-POP4检测的LIZ500片段的单碱基分辨率普遍高于ABI POP-4, 幅度在0.35~0.1, 且这种差别也体现在大片段中。

在毛细管电泳中, 稳定的电流是获得重复性分析结果的关键因素[10]。在DNA片段数据收集过程中, ABI POP-4的电流在140~190之间波动, 波动范围为50; NuHi POP4的电流在90~110之间波动, 波动范围为20, 电流小, 波动范围减少了60%。

在法医DNA检测中, 迁移时间与所含碱基对数目间具有线性关系, 由此作出线性关系图(见图4)。从图4看出, NuHi-POP4的直线相关系数R2为0.9996, 比ABI POP-4的相关系数0.9994更接近于1。

经测试, NuHi-POP4检测生物检材样品的结果分型均与ABI-POP4检测的结果分型一致, 证实NuHi-POP4检测所分析的基因分型结果可靠。

当法医鉴定的样品数量巨大时, 如何在短时间内高效分析是一大难题, 一方面与分离用毛细管的数量直接成正比, 另一方面也可以通过缩短单个样品的分析时间来提高效率。国产NuHi-POP4胶在使用过程中不仅表现出电流稳定, 分辨率高的特点, 更能够在不降低分辨率的前提下显著缩短样品分析时间, 大大提高了法医鉴定工作效率。但是, 对于在室温中处于更长时间, 或者长期使用, 是否有未及预见的优缺点, 有待于更深入地测试研究。

本实验所使用的美国AB公司生产的ABI POP-4、AmpFlSTR Identifiler Plus扩增试剂盒及GS500LIZ分量内标均已商业化, 并在国内大规模使用, 而未见国产基因分离胶在实际工作中的应用及有关于国产基因分离胶的报道。国产基因分离胶如果通过一定的实验验证, 走向实际应用, 必在实验成本方面占有极大的优势, 实际工作中拥有广阔的前景。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
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