方法的优劣是由方法质量决定的, 方法质量是方法属性的总和, 它体现方法在一定条件下使用时满足明确和隐含要求的能力和程度^[2]。方法质量应从两个方面来考量, 即基于方法本身和基于使用者的质量要求。方法质量由已定义的质量模型来评价, 质量模型是一组特性及特性之间的关系, 它提供规定质量要求和评价质量的基础。方法质量模型是体现方法各特性及相互关系的整体, 由方法本身的质量特性即内部质量和方法使用阶段的质量特性即外部质量构成^[3]。内部质量与外部质量既相互依赖又相互影响。建立一个合适的、易于理解的方法质量模型对方法的开发和评价起到关键的作用。

内部质量是衡量方法在特定条件下使用时满足明确和隐含要求的能力^[4]。它是基于内部视角的方法属性的总体, 即来自于方法自身的技术特性的总和。它亦是对于方法研发者而言的主导性内容。

1.2.1 功能性 用来衡量方法是否满足规定的功能需求和隐含的使用要求。

(1)适用性:方法在正常使用条件下满足预定使用功能要求的能力。

(2)适应性:方法与环境相适合的程度。

(3)合理性:方法在一定的标准和原则上所符合的价值需求和技术要求, 包括价值合理性、目的合理性和工具合理性三个层面。

1.2.2 可靠性 用来衡量方法是否满足规定的可靠性要求。

(1)专属性:指在其它成分如杂质可能存在下, 采用的分析方法能够正确鉴定、检出被分析物的特性, 专属性要确证被分析物能与杂质及其它共存物质得到分享和检出。

(2)准确度:检测结果与真实结果的符合程度, 总体反映方法的系统误差和随机误差, 准确度包含正确度和精密度两方面。

(3)灵敏度:方法的输出变量对方法特性或参数变化的敏感程度, 它反映方法在特性或参数改变时偏离正常运行状态的程度。

1.2.3 可操作性 用来衡量使用者操作和控制方法的能力。

(1)方便性:指使用者进行完整操作的容易程度。

(2)耐用性:指在测定条件有小的变动时, 测定结果不受影响的承受程度。

(3)稳定性:指抵抗外来影响的稳健性, 衡量受外因导致结果差异或失效的程度, 这种程度越小稳定性越强。

外部(使用)质量是衡量使用条件中方法使用户达到特定目标所要求的有效性、效率、安全性及满意度的能力^[5]。它是基于使用者观点的方法用于指定的环境和使用时的质量, 它度量使用者在特定环境中能达到其目标的程度, 而不是度量方法自身的属性。

1.3.1 有效性 评估在特定的实验环境中使用者是否能够准确和完全达到规定的目标, 主要以任务有效率和出错频率来考量。

1.3.2 易用性 评估方法被理解、学习、使用和被吸引的程度, 主要以易操作性、易理解性、易学性来考量。

1.3.3 效率 评估在特定的实验环境中使用者消耗的与所达到的有效性相关的资源。最常见的资源是完成的时间, 可以任务效率和成本有效率来考量, 一般任务有效率以时间计量, 成本有效率以消耗量计量。

1.3.4 安全性 评估在特定的实验环境中, 对人、环境等产生伤害的风险程度。包括使用者以及那些受使用影响的人的健康和安全以及意想不到的生理的或经济的后果, 具体指可能使人身受到健康和安全问题的影响因素和范围。

2.1.1 毒物的种类 根据研究、分析目的不同, 毒物的分类方法也不尽一致, 在化学分析领域常常按其理化性质分类, 在法医学上, 为追溯毒物来源、用途及其对机体的作用时, 则多采用混合分类, 主要包括9类。

(1)农药:包括有机磷类、拟除虫菊酯类、氨基甲酸酯类、除草剂及其它水溶性农药, 如甲胺磷、对硫磷、甲拌磷、敌敌畏、敌百虫、灭多威、涕灭威、草甘膦、百草枯和阿维菌素等。主要采用的检测方法有气相色谱法、液相色谱法、薄层色谱法和化学分析方法。

(2)杀鼠剂:包括毒鼠强、氟乙酰胺、溴敌隆、大隆、磷化锌等。主要采用的检测方法有气相色谱法和液相色谱法。

(3)金属毒物:如砷、汞、锌等及其化合物。

(4)挥发性毒物:如氰化物、一氧化碳、硫化氢、醇、酚、苯等。主要采用的检测方法有顶空气相色谱法。

(5)临床药物:包括安眠镇静药、麻醉剂、止痛剂、抗精神病药等, 如氯丙嗪、异丙嗪、氯氮平、利多卡因、氯喹、地西泮、三唑仑、阿普唑仑、哌替啶、利眠宁、丁丙诺啡、芬太尼、地芬诺酯、美沙酮。主要采用的检测方法有气相色谱法、液相色谱法、薄层色谱法和紫外分光光度法。

(6)毒品(滥用药物):如吗啡、单乙酰吗啡、大麻、氯胺酮、可卡因、苯丙胺、去氧麻黄碱、二亚甲基双氧甲基安非他明、替苯丙胺、四氢大麻酚、四氢大麻酸、海洛因等。主要采用的检测方法有气相色谱、液相色谱和薄层色谱法。

(7)植物毒素:如乌头碱、马钱子碱、士的宁等。主要采用的检测方法有液相色谱法、气相色谱法和薄层色谱法。

(8)动物毒素:斑蝥素、河豚毒素等。主要采用的检测方法有气相色谱法和薄层色谱法。

(9)无机毒物:如强酸、强碱、亚硝酸盐等。

2.1.2 样品的前处理方法 生物样品中含有大量的内源性物质如蛋白质、脂肪等, 且毒物进入生物体后亦会发生一系列复杂的变化如毒物及代谢物与蛋白结合, 微生物或酶造成毒物的分解等等, 因此需对样品进行前处理。

(1)预处理方法

①丙酮-水浸泡法:适用于一些高度腐败的生物样品或含油脂较多的组织如腐败肝、胃、肾等。通常取脏器或体液用丙酮/水混合溶剂浸泡, 浸泡液浓缩后再进行提取、净化。有9个技术方法采用了丙酮-水浸泡法。

②水解法:有些毒物在体内会与蛋白质或葡萄糖醛酸等形成结合物, 需要通过水解的方式使结合状态的毒物释放出来以利于提取。有4个技术方法涉及到水解法。

③微波消解法:该法适于处理大批量样品及萃取极性与热不稳定的化合物, 优点是加热快、升温高、消解能力强, 大大的缩短了溶样时间。

(2)提取方法

①液-液提取法:适于多数生物样品, 可以依据待测目标物的性质选择合适的有机溶剂提取。15个技术方法建立了液-液提取法。

②沉淀蛋白-直接提取法:利用有机溶剂除去一些蛋白质, 常用的有机溶剂有甲醇、乙腈等。多适用于血、肝等生物样品的处理。有15个技术方法采用了沉淀蛋白直接提取法。

③液-固提取法:按照固相萃取剂的种类, 可分正相、反相和离子交换固相萃取。该法特别适用于血、尿等生物样品的制备。大部分技术方法采用了液-固提取方法。

(3)净化方法:对于一些高度腐败或色素较重的生物样品需要在提取后净化, 包括过中性氧化铝柱、硅镁吸附剂、酸碱反提等。

(4)衍生化方法:主要目的是使一些不稳定、极性强的毒物转化成稳定、易分离、检测灵敏度高的衍生化合物。有14个技术方法采用了衍生化技术。

2.1.3 检测方法 生物样品中毒物的含量通常很低, 应选择高灵敏度、高选择性的检测方法。在毒物分析领域, 常用的分析方法主要包括色谱法、光谱法和化学分析方法等。

(1)色谱法

①气相色谱法:主要适合一些易挥发和对热稳定的化合物, 较常用的有气相色谱法、气相-质谱联用法和顶空气相色谱法。28种技术方法采用了该检测技术。

②液相色谱法:可直接分析非挥发性、热不稳定性和大分子毒物, 如动植物毒素、抗生素和药物结合型代谢物等。常用的有高效液相色谱法、液相色谱串联质谱以及离子色谱等。有18种方法采用了该检测技术。

③薄层色谱法:薄层色谱法是一种经典的快速分析方法, 具有分离和鉴定的双重功能, 通过薄层色谱与对照品图谱相比较或目标物展开后与显色剂显色能够鉴别出特征成分。有9种行业技术标准方法采用了薄层色谱法。

(2)光谱法

光谱法是利用物质与电磁辐射作用, 物质内部发生量子化能级跃迁而产生的吸收、发射或散射等电磁辐射的强度随波长发生变化的定性、定量的分析方法。如红外光谱法、紫外可见分光光度法、荧光光度法、电子耦合等离子体-质谱联用(ICP-MS)法等。由于对待测样品的特定要求, 光谱法在法医毒物分析中的应用相对有一定局限性, 目前建立的技术方法很少。

(3)化学反应法

毒物与某些化学物质发生反应, 出现颜色变化。化学反应法由于灵敏度相对较低、特异性不强, 因而大多作为初筛和辅助检验手段。如检验氟乙酸根离子用的硫靛反应、检验氰离子用的普鲁士兰反应等。

2.1.4 结果评判 在所有的技术方法中, 分别对定性结果和定量结果做出可靠性与非可靠性结果分析。

(1)定性结果分析:通过计算标准物质的回收率对定性结果进行评价。

如果阳性对照样品的回收率在60%以上, 则阴性结果可靠; 如果阳性对照样品中回收率低于60%, 则样品阴性结果不可靠, 应重新检验。待测样品出现与标准品保留时间相同的色谱峰, 且质谱特征离子碎片及相对丰度一致, 阴性对照样品无干扰, 则阳性结果可靠。阳性对照样品的添加含量小于一定值时, 可按照阳性对照品色谱峰的信噪比进行判断阴性结果是否可靠。

(2)定量结果分析:根据所选择的定量方法进行计算和数据分析。

外标法包括标准曲线定量法和外标单点定量法, 分别代入相应的公式计算目标物的含量。内标法是根据标准品和内标物的峰面积及添加量计算校正因子, 然后代入公式计算目标物的含量。定量数据分析及质量控制:记录2份平行操作的样品含量, 按相对相差公式计算, 如果样品中目标物含量的RD﹥20%, 则定量数据不可靠。

(3)在结果评判中, 针对定性结果主要从回收率、保留时间、碎片峰及相对丰度、信噪比等方面进行结果评判; 针对定量结果主要以相对相差作为评判标准。结果评判是衡量技术方法准确与有效的重要指标, 应在上述结果分析中进一步细化并强化。

以前述的73个技术方法为重点研究对象, 在方法的适用范围、样品的前处理、样品的检测方法和结果分析等方面进行系统总结, 并依据技术方法的内部质量和外部质量基本要求, 结合本专业技术特点, 提出毒物检验方法的质量要求, 即从以下4个维度对方法质量提出要求。

2.2.1 功能性要求 功能性维度要求主要包括适用对象的特定与非特定要求、方法使用的物质要求和方法的技术合理性要求等。从方法的适用性角度, 重点体现在方法的适用范围, 检验方法应当有明确的适用范围, 适用范围是针对被测目标物(毒物成分)和被检验对象(检材种类), 即方法适用于某一类毒物还是仅仅适用于某一毒物, 适用于单一还是某些检材, 这是衡量方法的通用性与专用性。从方法的适应性角度, 方法还应当有明确的使用要求, 既在什么条件下该方法有效或受限。从方法的合理性角度, 应当有明确的理论依据, 技术可行性强。

2.2.2 可靠性要求 可靠性要求从方法的技术质量角度, 重点体现在方法的准确性和有效性上。对于毒物定量检验来讲, 检测的结果准确、可靠、稳定等都至关重要。为此, 需要对毒物检验方法的准确度、不确定度、重复性和复现性等提出具体要求^{[7, 8]}。灵敏度也是方法的一项基本性能指标, 一个良好的方法应当具有尽可能高的灵敏度。理论上讲, 灵敏度通常分为稳态灵敏度和动态灵敏度, 对一个检验方法而言, 灵敏度即要反映仪器对被测目标物(毒物)的检测限, 又要反映对复杂基质中目标物检验的方法检出限。对方法的可靠性进行评价十分重要, 直接影响到方法在实际案件中应用的好坏。

2.2.3 易用性要求 一个成熟、良好的方法在技术层面应当具有较好的耐用性, 有较强的抵抗干扰和其它因素的能力, 并达到一定的稳定性。同时, 对使用者而言, 要提高方法操作和运行控制的能力, 方法应当便于操作, 容易被掌握, 力求减少复杂、繁琐的操作过程。使用者在学习、理解并掌握方法的过程中, 不应受到错误的指引, 产生专业上的争议。易用性要求包括对方法的易操作性、耐用性和易学性等做出明确要求。

2.2.4 有效性要求

涉毒案件的检验工作将直接为侦查、破案和诉讼活动提供线索和证据, 而侦查与诉讼是有时限要求的, 速度上的快慢有时将决定案件侦破的可能性, 诉讼的有效性, 为此对于涉毒案件检验方法的评价也应当考虑到时间要求问题。另外, 我国地域辽阔, 地区间经济发展极不平衡, 因此, 各种检测方法对设备、试剂的高低要求, 即检测成本将制约方法的使用与普及。为此, 在评价各种方法时应当对其投入成本进行分析, 以供不同经济实力的实验室进行选择。有效性要求包括对方法的使用效率、方法的使用成本、方法使用的安全性等做出明确要求。

图1

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	图1 毒物检验方法质量模型

一套完善的技术方法应当包含以下的主要内容:方法名称、技术原理、方法的适用范围、检材的条件要求、实验材料、检验过程、结果描述与评价等等。还应包含与技术方法相关的资料、注意事项等以附录的形式表示。