总RNA绝对含量≥ 500ng/μ L、OD值在1.8~2.0之间、凝胶电泳后用弱紫外光检测(UV340nm)可见明显的28s、18s及5s的条带(见表1、图1)。管家基因GAPDH之PCR产物电泳检测能见到对应大小的片段(见图2)。

表1

表1

表1 总RNA含量及OD值表 样品 RNA含量(ng/μ L) OD值(260/280) 1 849.6 1.89 2 1008.7 1.92 3 932.1 1.97

表1 总RNA含量及OD值表

图1

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图1 总RNA电泳图(1、2、3为样品, M为DNA Marker);

图2

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图2 管家基因GAPDH之PCR产物电泳图(1、2、3为样品, M为DNA Marker)

真核生物细胞有4种RNA, 以rRNA(主要是28S、18S和5S)为主^[1]。在总RNA的提取中, 常用能否提得高纯度的完整总RNA作为评价一种方法好坏的标准。影响总RNA的完整性主要是内外源性的RNA酶, 而影响总RNA纯度主要是在提取过程中, DNA及组蛋白是否完全去除。

内源性的RNA酶由组织本身决定, 尽量减少内源性RNA酶的作用时间或使其无活性是解决问题的关键。在本实验中, 将取下的组织立即用液氮浸泡数分钟, 直至组织块不冒气泡、完全沉到液氮底部为止, 使组织温度骤降, RNA酶暂时失去活性, 如果需要短期保存组织检材, 则在液氮浸泡后再存于-70℃冰箱中。对于外源性的RNA酶, 主要是整个提取过程的无RNA酶操作。为了尽量减少外源性RNA酶的干扰, 本实验做到:

(1)对实验用金属器械、玻璃仪器等用400℃高温灭活RNA酶, 塑料制品等用1/1000强RNA酶抑制剂DEPC水浸泡过夜, 并高压煮沸处理;

(2)整个实验在超净工作台中完成, 操作者带口罩、帽子, 并在实验过程中勤换手套;

(3)在匀浆组织前, 先在冰上预冷玻璃匀浆器和Trizol, 整个匀浆过程均在冰上完成;

(4)提取的总RNA立即快速检测, 并立即逆转录成cDNA。本实验采用高敏的ND-100分光光度计及1%琼脂糖凝胶电泳双重检测, 以确定RNA绝对含量、OD值等。在琼脂糖凝胶电泳时, 电压适当偏大, 减少电泳时间, 减少电泳过程中RNA的降减, 本实验中电泳电压为15V/cm, 电泳时间10min。结果显示28S的条带明显亮于18S的, 提示降解少, 可逆转录。

去除DNA及组蛋白的关键在氯仿分离步骤。匀浆后的组织液中加入氯仿、振荡、离心后, RNA、DNA及组蛋白分为上、中、下三层, RNA溶解在上层水相中。因RNA含量少, 提取过程中应尽量多地转移上层水相中的RNA到新管进入洗涤步骤, 这也常使DNA、组蛋白成份被误吸入水相。为了转移更多RNA水相又防止误吸其它杂质, 本实验采用小枪头少量多次吸取, 直至吸取最后一份纯清的上层水相。从OD值的检测看, 此方法提取的RNA纯度较高, 符合实验要求。

在提取过程中, 还应注意两个问题:

(1)关于检材处理与Trizol用量。对每个检材需要的样本量, 试剂公司建议50mg/mL~100mg/mL Trizol, 甚至建议每次检材用量小于50mg。但在本实验中, 发现用100mg的检材, 甚至稍微大于100mg同样可以获得满意的结果, 可能提示对于RNA含量较低或降解较严重的检材(如尸体法医学病理解剖所提取的检材), 可以适当加大检材量。

(2)醇类对核酸反应具有较强的抑制作用, 因此弃去乙醇后的风干步骤十分重要, 应尽量使管壁的乙醇风干, 但也不能风干太彻底, 因为过于风干会使RNA粘附管壁不易溶解, 应以管壁乙醇挥发完全、管底RNA尚未开裂为宜。

另外, 对于取下的检材, 实验分别比较了取下心肌组织, 先用液氮浸泡数分钟, 后立即放入Trizol液中匀浆并提取RNA; 液氮浸泡后立即匀浆, 后冻存于-70℃; 液氮浸泡后直接存于-70℃; 以及死后放置2h再用液氮浸泡, 然后提取RNA。结果显示, 液氮浸泡后立即匀浆提取、立即匀浆保存与直接存于-70℃之间没有明显差异, 都能提得RNA, 而死后不立即取材的组织(死后放置2h)则较难得到满意的结果。本实验提示, Trizol法可以从新鲜心肌组织中提取到满意的总RNA, 是提取总RNA可靠有效的方法, 可望在法医病理学研究与实践中有较广的应用。至于具体死后多长时间内能从心肌组织中提取出较好的RNA, 不同气温等条件下有何变化, 本实验没有具体涉及, 有待于进一步研究, 刘季等研究显示死后4d~5d内仍能从大鼠脑组织内提取出RNA^[2]。