引用本文
刘亚举, 张丽娟. 自动化工作站批量提取现场生物检材DNA的应用[J]. 刑事技术,2014,39(2): 60-61
[J]. Forensic Science and Technology,2014,39(2): 60-61  
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自动化工作站批量提取现场生物检材DNA的应用
刘亚举1, 张丽娟2
1.河南省许昌市公安局刑事科学技术研究所,河南许昌 461000
2.河南省长葛市公安局刑侦大队,河南长葛 461500
摘要
关键词: 现场生物检材; 磁珠法; 自动化工作站; STR检验
中图分类号:DF795.2 文献标志码:B 文章编号:1008-3650(2014)02-0060-02

DNA实验室受理的案件检材数量日益增加, 传统的手工检验方式已不适应形势要求, 探索寻求案件生物检材快速批量DNA提取检验势在必行, 本文通过Hamilton STAR-LET自动化工作站结合AGOWA sbeadex○R法医试剂盒建立了适应大部分案件生物检材高通量DNA提取的方法, 提高了检案效率, 报道如下。

1 材料与方法
1.1 材 料

实验室日常受理检验的案件生物检材2627份, 其中包括血迹1127份(承载体如泥土、水泥地面、棍棒、砖石块、刀具、铁锨、家具、衣物), 烟蒂960份, 阴道擦拭物和内裤120份(其中1995-2004年15份), 肋软骨50份, 流产胎儿组织20份, 带毛囊毛发30份, 防盗门猫眼粘贴口香糖20份, 可疑脱落细胞类检材300份(衣服、头套、口罩、手套50份, 饮料瓶、吸管180份, 工具触摸类70份)。

1.2 仪器与试剂

Hamilton STAR-LET自动化工作站(AusBio公司, 瑞士); 平板离心机(Eppendorf公司, 德国); 9700型PCR扩增仪(AB公司, 美国); 3500XL型遗传分析仪和ID-X分析软件(AB公司, 美国)。Identifiler○R Plus试剂盒(AB公司, 美国); AGOWA sbeadex○R法医试剂盒(LGC公司, 英国)。

1.3 方 法

1.3.1 检材预处理 (1)血迹、烟蒂、肋软骨、流产胎儿组织、带毛囊毛发:参照文献[1]方法处理; (2)阴道擦拭物和内裤:剪取检材适量, 使用差异裂解法去除女性物质, 将洗涤后的沉渣100μ L转移至96孔深孔板的管孔, 再加入DTT 20μ L; (3)口香糖:冷冻后切取约5mm× 1mm大小; (4)头套、口罩、手套:直接剪取重点部位, 手套可以多取几处; (5)衣服:用脱落细胞提取仪(公安部物证鉴定中心研发)吸取衣领和袖口处, 剪取第二层滤膜检验; (6)饮料瓶、吸管:用生物物证提取棉签(公安部物证鉴定中心研发)干湿“ 两步法” 擦拭, 擦拭过程中尽量用棉签的顶端部; (7)工具触摸类:光滑客体先用生物物证提取棉签干湿“ 两步法” 擦拭, 再用EZ-tape胶带(公安部物证鉴定中心研发)粘取; 渗透性客体, 如绳索, 要分段转移, 先用脱落细胞提取仪吸取, 再用EZ-tape胶带粘取[2]。

1.3.2 DNA提取 编制与96孔深孔板相对应的检材提取表, 预处理后的检材置于深孔板的对应圆形管孔底部, 使其处于蓬松状态, 然后将96孔深孔板放置在Hamilton STAR-LET自动化工作站的加热模块上, 按照AGOWA sbeadex○R法医试剂盒提供的提取方法, 在Hamilton STAR-LET(8道)自动化工作站上编写磁珠法提取程序, 进行自动化提取, 并用40μ L洗脱液进行洗脱, 最后收集DNA溶液到PCR板中。

1.3.3 PCR扩增及其分型 采用10μ L体系的Identifiler○RPlus试剂盒在9700型扩增仪上按标准程序29个循环进行复合扩增, 其中Master Mix4μ L、Primer Set2μ L; 血迹、烟蒂、肋软骨、流产胎儿组织、阴道擦拭物和内裤、口香糖的DNA模板为1μ L, 头套、口罩、手套、衣服、饮料瓶、吸管、带毛囊毛发的DNA模板为2μ L, 工具触摸类的DNA模板为4μ L; 不足体系的纯水补充。3500XL型遗传分析仪上全自动毛细管电泳, Collection软件收集数据, 用GeneMapperID-X软件进行等位基因分型。

2 结 果

以获得性别及13个以上STR基因座明确分型的为成功, 不同种类检材的检验成功率不大相同, 2627例各类生物检材具体检验结果见表1。

3 讨 论

目前, Hamilton STAR-LET自动化工作站在河南DNA实验室进行人员血样DNA数据库建设中起着重要作用[3], 它的提取方法程序设置是一个开放的平台[4], 但随着人员血样直接扩增STR试剂盒的应用, Hamilton STAR-LET自动化工作站的再利用是关键。本文方法的建立基于Hamilton STAR-LET自动化工作站有以下优点:(1)程序操作可控性, 根据检材数量和洗脱体积而灵活设置。(2)处理1个96孔板需要耗时115min, 适应快速提取纯化。(3)检材细胞裂解和DNA洗涤在96孔深孔板中进行, 每个圆形管孔的容积达1.7mL, 实际工作所需容积1.2mL, 添加的裂解液可以将检材完全浸没; 同时加热模块的独特性和更高的裂解温度, 能与深孔板完美融合, 即能快速升温又能使检材受热均匀。(4)震荡模块的稳定性, 2000r/min振摇, 液体也不易溢出管孔。(5)TIP头的精密度, 保证了移液的准确性, 避免了人为经验式操作, TIP头吸液采用反喷技术, 防止了样本间的交叉污染。(6)兼顾后续工作, 根据3500XL型遗传分析仪特点, 在检材预处理时, 每个Run任意添加布置阴阳性对照, 运用ID-X分析软件Profile Comparison功能检查检验过程中是否有污染, 依据数据的分析复核, 起到监督交叉污染现象。

表1 采用自动化工作站提取各类案件生物检材DNA的STR检验结果

本文采用的AGOWA sbeadex○R法医试剂盒中的高效裂解液能使细胞DNA充分释放, 适用于法医现场各类检材。其磁珠颗粒微小, 具有小尺寸效应和表面效应, 可以对小的或大的DNA片段高质量地纯化, 保证更强的磁性及分离效果; 结合缓冲溶液能驱使磁珠与DNA特异结合; 经过两种特殊的洗液洗涤增强了去除抑制物的作用, 洗涤过程中无需干燥即可洗脱, 节省了操作时间, 40μ L洗脱液溶解的DNA半定量效果好。作者对手套、衣服和工具触摸类(如绳索)检材分段提取[5], 如果没有得到完整STR分型, 分析判读来源于同一人时, 就将同种检材不同部位提取得到的DNA溶液合并, 再联合使用斜底面(30K)的Microcon-100柱浓缩[6], 因为这种方法没有额外变换DNA溶液成分, 只是将多余水分过滤掉, 从而集中了DNA溶液浓度, 所以更能提高此类检材的检出成功率。同时对陈旧阴道擦拭物和内裤上的精斑也有很高检出率, 实验室2012年下半年受理的1995~2004年15份混合斑均检出成功分型。

本研究说明, 大部分的现场生物检材利用该自动化工作站可以得到较高的成功率, 主要做法是:(1)主张原物提取物证, 然后由DNA检验人员进行生物检材富集转移; (2)及时发现与送检物证, 以免微量细胞降解; (3)与现勘人员互动沟通, 寻求生物检材遗留部位, 以及哪些部位检出的DNA可能是嫌疑人所留; (4)检验结果积极反馈, 能够指导现勘人员的勘验; (5)STR扩增试剂盒的选择, 本研究选取了ID-Plus, 因为此试剂盒提高了抗PCR抑制能力、提高了扩增信号、减少了PCR伪峰, 经过29个循环, 所检出的STR峰型尖锐清晰、平衡性好, 但也有表现为DNA模板量大的, 因此就要不断摸索调整扩增模板量。

综上所述, 本研究利用自动工作站建立的标准化流程, 可以大大缩短案件生物检材的DNA提取纯化时间, 结果准确、可靠、成功率高, 适合日常案件生物检材批量检验需求。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
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