固相支撑液液萃取-气相色谱串联质谱法测定血液中8种苯二氮䓬类药物

引用本文

李晓飞, 唐磊, 罗永此, 姚焕焕. 固相支撑液液萃取-气相色谱串联质谱法测定血液中8种苯二氮䓬类药物[J]. 刑事技术,2014,39(2): 27-29
LI Xiao-fei, TANG Lei, LUO Yong-ci, YAO Huan-huan. Determination of benzodiazepines drugs in blood using isolute SLE-supported liquid extraction and GC-MS/MS[J]. Forensic Science and Technology,2014,39(2): 27-29 复制到剪切板

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《刑事技术》编辑部

固相支撑液液萃取-气相色谱串联质谱法测定血液中8种苯二氮䓬类药物

李晓飞, 唐磊, 罗永此, 姚焕焕

杭州市公安局刑事科学技术研究所,杭州 310004

作者简介:李晓飞(1981—),男,河南新安人,工程师,工学硕士,主要从事毒物分析。Tel:0571-87282695; E-mail:Leefox1@163.com

摘要

目的建立一种全新的固相支撑液液萃取-气相色谱串联质谱检测血中8种苯二氮䓬类药物的方法。方法用固相支撑液液萃取柱(SLE)对样品进行分散及固定,乙酸乙酯进行洗脱,然后用气相色谱-串联质谱仪测定。结果 8种苯二氮䓬类药物的质量浓度与其峰面积均在10~1000ng/mL之间呈线性关系,检出限(3S/N)在0.3~2.5ng/mL之间,以空白血液样品为基体进行回收试验测得回收率在85.2%~98.2%之间,测定值的相对标准偏差(n=5)在2.1%~6.1%之间。结论该方法具有消耗检材少、简便、快速、准确和灵敏度高等特点。

关键词: 苯二氮䓬类; 血液; 固相支撑液液萃取; 气相色谱-串联质谱; 毒物检验

中图分类号:DF795.1 文献标志码:A 文章编号:1008-3650(2014)02-0027-03

Determination of benzodiazepines drugs in blood using isolute SLE-supported liquid extraction and GC-MS/MS

LI Xiao-fei, TANG Lei, LUO Yong-ci, YAO Huan-huan

Institute of Forensic Science of Hangzhou City,Hangzhou 310004, China

Abstract

Objective To develop a GC-MS/MS method for determination of benzodiazepines in blood.Methods Samples were extracted with supported liquid extraction columns and eluted by ethyl acetate. The collected solutions were analyzed by GC-MS/MS.Results The calibration curve was linear in the range of 10ng/mL~1000ng/mL. The limit of detection (LOD) was in the range of 0.3~2.5ng/mL.The average recoveries were in the range of 85.2%~98.2%, and the relative standard deviations were in the range of 2.1%~6.1%.Conclusion The method had high sensitivity and selectivity, and was suitable for determination of benzodiazepine in blood.

Keyword: benzodiazepine; blood; supported liquid extraction; GC-MS/MS

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苯二氮䓬类药物是一类中枢神经抑制剂, 临床上常作为镇静催眠药使用, 亦用于癫痫、焦虑等症的治疗。血液中该类药物的检测在临床救治以及司法鉴定中具有重要的意义。应用较多的主要有地西泮、咪哒唑仑、氟硝西泮、硝西泮、氯硝西泮、艾司唑仑、阿普唑仑和三唑仑。

本研究采用固相支撑液液萃取技术对少量(0.5mL)血液检材进行前处理, 建立了气相色谱-三重四极杆串联质谱法测定8种苯二氮䓬类药物的定性定量分析方法, 报道如下。

1 材料和方法

1.1 试剂与仪器

Biotage ISOLUTE SLE+固相支撑液液萃取柱; Varian 450-GC/320-MS/MS气相色谱-三重四极杆串联质谱联用仪。

地西泮、咪哒唑仑、氟硝西泮、硝西泮、氯硝西泮、艾司唑仑、阿普唑仑和三唑仑对照品(均购自公安部物证鉴定中心), 用色谱纯甲醇配制成每种分析物各0.1mg/mL的混合标准工作液。

缓冲液: 美国TEDIA pH为8, 10, 12的标准缓冲溶液。

环己烷、乙酸乙酯、二氯甲烷、甲醇均为色谱纯; 水为二次蒸馏水。

1.2 仪器工作条件

气相色谱条件: VF-5 MS色谱柱(30m× 0.25mm × 0.25μ m); 载气为高纯氦气(纯度99.999%), 流量为1.0ml/min, 汽化室温度为260℃; 分流比为10∶ 1; 进样量为1.0μ L。程序升温:柱起始温度100℃, 保持1min, 以20℃/min速率升至280℃, 保持15min。

质谱条件:传输线温度为280℃; 离子源温度为200℃; 电子轰击(EI)离子源; 电离能量为70eV; 溶剂延迟时间为3min; EDR电压为1300V; 碰撞气为高纯氩气(纯度99.999%); 碰撞气压力为240mPa; 质谱扫描方式为多反应监测(MRM)。

1.3 血液样品的处理

准确移取加入8种药物的血液0.5mL, 加入pH10的缓冲溶液0.5mL。混匀后将样品加入固相支撑液液萃取柱中, 施加一个2s~10s的真空, 待样品全部均匀分散在填料上后, 静置5min。用2mL× 3mL乙酸乙酯洗脱, 控制其流速在1ml/min左右, 每次在溶剂自然滴完后施加一个正压将柱中残余的液体挤出。洗脱液用氮气吹干后, 用甲醇定容至0.5mL, 在仪器工作条件下进行测定。

2 结果

2.1 萃取溶剂的选择

实验采用乙酸乙酯作为萃取溶剂, 结果表明乙酸乙酯和二氯甲烷作为萃取溶剂时的回收率明显高于环己烷。

2.2 萃取体系pH值的选择

本研究考察了萃取体系分别为pH8、pH10、pH12条件下对萃取效率的影响, 结果表明, pH为10时, 8种药物的平均萃取效率最高。

2.3 萃取溶剂用量及洗脱次数的选择

考察了每次用2mL、3mL、4mL、5mL萃取溶剂, 洗脱次数分别为1次、2次、3次时各个药物的回收率, 结果表明当萃取溶剂用量在3mL时, 各药物回收率已达最高, 故选用2mL× 3mL乙酸乙酯洗脱。

2.4 质谱条件的优化

在固定的色谱条件下, 首先采用全扫描方式获得待测物的母离子, 然后在一级质谱MS1选择性收集母离子, 利用碰撞气将母离子打碎后在二级质谱MS2收集子离子。根据不同碰撞能量下产生的子离子, 选择丰度相对较高、较稳定的子离子进行检测。试验在碰撞能量为5~40V的范围内对8种苯二氮䓬类进行优化, 质谱参数见表1, 其中带* 离子为定量离子, 总离子流图见图1。

表1 8种苯二氮䓬类药物的质谱参数

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	图1 8种苯二氮䓬类药物的总离子流图

2.5 回收实验

采用空白血样加标的方式进行回收率实验, 分别添加3个水平, 每个水平单独测定5次, 回收率和精密度结果见表2。

表2 回收率和精密度(n=5)

2.6 工作曲线和方法检出限

配制8种药物浓度分别为10、20、50、100、200、500、1000ng/mL的标准溶液, 按试验方法测定。以峰面积 (y)对样品中药物的质量浓度(x, ng/mL)作图, 8种药物的线性范围、线性回归方程和相关系数见表3。8种药物浓度为20 ng/mL的标准溶液进样, 以子离子丰度较低的子离子峰强度的信噪比(S/N)为3计算检出限(LOD), 检出限见表3。

表3 8种药物相关系数

药物名称	线性范围 (ng/mL)	线性方程	相关系数	检出限 (ng/mL)
地西泮	10~1000	$\begin{matrix} y = 2.10 \times 10^{2} + 7.58 \times 10^{3} \end{matrix}$	0.9950	1.1
咪哒唑仑	10~1000	$\begin{matrix} y = 1.85 \times 10^{2} + 5.99 \times 10^{3} \end{matrix}$	0.9972	0.3
氟硝西泮	10~1000	$\begin{matrix} y = 1.10 \times 10^{3} + 1.92 \times 10^{4} \end{matrix}$	0.9991	2.0
硝西泮	10~1000	$\begin{matrix} y = 5.31 \times 10^{2} - 7.87 \times 10^{3} \end{matrix}$	0.9998	1.1
氯硝西泮	10~1000	$\begin{matrix} y = 8.01 \times 10^{2} - 6.31 \times 10^{3} \end{matrix}$	0.9997	0.6
艾司唑仑	10~1000	$\begin{matrix} y = 6.19 \times 10^{2} + 2.48 \times 10^{3} \end{matrix}$	0.9996	1.1
阿普唑仑	10~1000	$\begin{matrix} y = 4.57 \times 10^{2} + 3.27 \times 10^{3} \end{matrix}$	0.9991	1.7
三唑仑	10~1000	$\begin{matrix} y = 9.73 \times 10^{2} - 5.85 \times 10^{3} \end{matrix}$	0.9998	2.5

表3 8种药物相关系数

3 讨论

苯并氮䓬类药物的提取一般都采用液液萃取法^{[1, 2]}、固相萃取法^[3]、固相微萃取法^[4]以及近年来发展起来的快速溶剂萃取法^[5]等, 固相支撑液液萃取柱的填料为经过高度改良的具有高比表面积的多孔硅藻土。当加入血液时, 样品在填料的表面扩散并被吸收, 形成特有的支撑骨架萃取模式, 将血液均匀的分散在填料中, 极大的增加了与有机溶剂的接触表面积。有机溶剂通过该柱时, 目标物被萃取至有机相, 血液基质则留在柱内, Klein J首次将固相支撑液液萃取技术应用于谷物中农药的检测^[6], 祝伟霞等人则用固相支撑液液萃取技术萃取食物中的硝基呋喃类代谢物^[7]。

本工作利用固相支撑液液萃取法提取血液中8种苯并氮䓬类药物, 气相色谱三重四极杆质谱法测定, 具有检材用量少、前处理简单、回收率好、灵敏度高、特异性强等优点, 可用于临床抢救及刑事案件血液中此类药物的分析, 尤其是仅能取得少量血液检材时应用。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献

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[6]	Klein J, Alder L . Applicability of gradient liquid chromatography with tand em mass spectrometry the simultaneous screening for about 10pesticides in crops[J]. J AOAC Internation, 2003, 86(5): 1015-1037. [本文引用:1]
[7]	祝伟霞, 袁萍, 杨冀州, 等. 固相支撑液液萃取-平行蒸发前处理技术测定动物源性食品中4种硝基呋喃类代谢物[J]. 食品科技, 2011, 36(2): 300-303. [本文引用:1]

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姜兆林, 朱昱, 谭家镒, 等. 乙酰衍生化气相色谱-电子捕获检测法分析尿中α-羟基三唑仑和α-羟基阿普唑仑[J]. 色谱, 2004, 22(6): 664 .

... 3 讨论苯并氮䓬类药物的提取一般都采用液液萃取法^[1,2]、固相萃取法^[3]、固相微萃取法^[4]以及近年来发展起来的快速溶剂萃取法^[5]等,固相支撑液液萃取柱的填料为经过高度改良的具有高比表面积的多孔硅藻土 ...

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2000

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王波, 朱明怀, 温锦丰. 固相微萃取膜提取人尿中的三唑仑[J]. 刑事技术, 2004(6): 43-44.

在麻醉抢劫案件中,三唑仑作为麻醉药物的案件占很大比例.在中毒者的尿液中提取该类药物,目前发展较快且效果较好的方法是固相萃取.唑仑类药物在尿中多以α位和4位羟基化代谢物与葡萄糖醛酸的结合物形式存在,原形药物较少,一般检验均先以β葡萄糖醛酸苷(ph6.8)在37℃下水解之后再提取.本文报告几起麻醉抢劫案件中的尿液直接以一种固相萃取膜进行提取,检出了三唑仑原药成分.

2010

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2003

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... 有机溶剂通过该柱时,目标物被萃取至有机相,血液基质则留在柱内,Klein J首次将固相支撑液液萃取技术应用于谷物中农药的检测^[6],祝伟霞等人则用固相支撑液液萃取技术萃取食物中的硝基呋喃类代谢物^[7] ...

2011

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祝伟霞, 袁萍, 杨冀州, 等. 固相支撑液液萃取-平行蒸发前处理技术测定动物源性食品中4种硝基呋喃类代谢物[J]. 食品科技, 2011, 36(2): 300-303.

硝基呋喃类药物的检测常以其代谢物为目标物,建立了鸡肉、蜂蜜、牛奶中呋喃唑酮代谢物(AOZ)、呋喃它酮代谢物(AMOZ)、呋喃妥因代谢物(AHD)和呋喃西林代谢物(SEM)检测的超高效液相色谱串联质谱确证方法,硝基呋喃代谢物经衍生化后,采用硅藻土固相支撑液液萃取和平行蒸发联用前处理技术进行净化和富集衍生物,超高效 1.7μm C18柱用于分离4种待测物,同位素内标法定量。AOZ和AMOZ为最低检测限为0.1μg/kg,AHD和SEM为0.25μg/kg。3个不同添加水平时该方法回收率为85.6%～104.3%,相对标准偏差(RSD)为3.2%～9.5%,通过对实际样品进行测定,结果表明该方法能简单、快速、准确地测定动物源性食品中4种硝基呋喃类代谢物。