水中脱落细胞DNA检验探讨
引用本文
栗正中, 高瀚, 刘倩. 水中脱落细胞DNA检验探讨[J]. 刑事技术,2013,38(5): 41-42
[J]. Forensic Science and Technology,2013,38(5): 41-42
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[J]. Forensic Science and Technology,2013,38(5): 41-42
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水中脱落细胞DNA检验探讨
关键词:
水中脱落细胞; 富集沉淀; DNA检验
中图分类号:DF795.2
文献标志码:B
文章编号:1008-3650(2013)05-0041-02
在涉及卖淫女的检案中, 会遇到遗留在现场的脸盆、脚桶等容器, 这些容器当中通常都会有残余的水等液体。如果案犯接触过这些容器中的水(多数的情况是用来洗涤), 那么理论上水中就有可能会留下案犯的皮屑、体液等微量生物检材。如何成功提纯和检验这些水中的微量检材往往会成为此类案件侦破的关键。本文结合2例涉及上述生物检材的案例, 成功获得水中脱落细胞DNA, 报道如下。
1 案件简介
案例1 2009年某日, 王某在卖淫过程中被抢劫伤害。技术人员勘查现场了解到王某在卖淫过程中曾为犯罪嫌疑人用水洗过生殖器, 约300mL水留在现场的一个红色水桶里。
案例2 2012年某日中午, 某镇某足浴按摩店业主郑某被发现死于店中。技术人员根据现场的遗留鞋印、行为状态等分析认为案犯有先洗脚、后杀人及清理现场的情况, 并提取了现场洗脚盆里约8000mL水及水中的毛巾进行DNA检验。
2 检 验
2.1 水中细胞的富集
案例1现场发现大约有300mL水, 分批次将水移入1.5mL离心管内, 13000r/min离心3min, 弃上清液, 留100μ L的沉淀。再将各离心管的沉淀物收集在一起分别放置1.5mL离心管, 再次通过13000r/min离心3min, 弃上清液, 留100μ L的沉淀物。按照此方法反复循环, 直至在一个离心管中收集保留100μ L的富集沉淀。
案例2现场发现的水中毛巾先取出并拧掉多余的水分, 然后在阴凉处晾干, 采用脱落细胞吸附器收集毛巾上通过擦脚而遗留的脱落细胞, 将所提取检材放置1.5mL离心管内待检。
案例2现场发现的洗脚盆内约有8000mL的水, 由于体积过大无法采用直接离心的方法。于是将洗脚盆沿立面呈45° 角放置24h, 使得盆内的少量残渣通过重力作用聚集于比较集中的部位。沿液平面抽取去掉脚盆内的上清液, 直至剩下2mL左右的底部残渣, 分批次将残渣移入1.5mL离心管内, 13000r/min离心3min, 弃上清液, 留100μ L的沉淀物。再将各离心管的沉淀物收集在一起分别放置1.5mL离心管, 再次通过13000r/min离心3min, 弃上清液, 留100μ L的沉淀物。按照此方法反复循环, 直至在一个离心管中收集保留100μ L的富集沉淀。
2.2 DNA的提取和检测
采用硅珠法[1]提取富集沉淀物中的DNA:分别将2份100μ L富集沉淀的水及脱落细胞吸附器的富集膜放入1.5mL离心管内, 加入200μ L TNE、30μ L 10%SDS、15μ L DTT、及高浓度的蛋白酶K(终浓度为200μ g/ml), 置37℃酶解振荡过夜。13000r/min 离心5min, 将上清转移到另一1.5mL离心管中, 加入3倍体积的裂解液, 加入25μ L硅珠悬浮液, 振荡放置15min, 高速离心, 弃上清后加入500μ L 漂洗液, 高速振荡后离心, 弃上清后加入500μ L 70% 冷乙醇漂洗2次, 高速离心, 弃上清, 56℃挥干乙醇。加入10μ L TE, 56℃孵育15min, 离心, 上清用于PCR 反应。对获得的模板DNA采用ABI公司的IdentifilerTM试剂盒, 采用20μ L扩增反应体系, 分别加入1μ L、2μ L、4μ L模板DNA进行梯度扩增, 置9700型扩增仪中进行30次循环扩增[2]。应用ABI-3130XL型基因分析仪电泳荧光检测。
3 讨 论
本文中, 人体组织经过水洗后, 会有少量上皮细胞脱落, 混入水中。但由于上皮细胞数量少, 直接取水来检测, 成功率极低。本文对于不同类型的水中脱落细胞采取了不同的方法进行提取富集是成功的关键:(1)对于体积少的水, 采取离心管直接离心的方法, 使脱落的上皮细胞沉淀于离心管底部。不断将沉淀的上皮细胞合并在一起, 直至所有的上皮细胞沉淀富集于一个离心管的100μ L溶液中。(2)对于体积多的水, 不宜直接离心沉淀的, 可采取选角度、长时间静置, 利用重力作用使脱落上皮细胞沉淀于面积较小的容器底部, 再采用离心的方法, 尽可能多收集到脱落细胞。(3)对于浸泡在水中的毛巾、衣物等, 应尽量动作轻柔地取出水面、拧干, 并在阴凉处晾干, 再采用脱落细胞吸附器或粘取器在犯罪嫌疑人可能接触到的部位进行提取。
因富集的沉淀细胞较多, 并含有较多杂质, 本文采用硅珠法进行DNA提取纯化, 在纯化之前加入高浓度的PK(终浓度达到200μ g/mL), 置37℃酶解过夜, 这个环节促使细胞核DNA得以充分释放与酶解, 从而获得较多的模板DNA。因硅珠对DNA具有较好的吸附力, 在冷乙醇清洗过程中, 有效去除了水中其它杂质和PCR抑制物, 获得相对较为纯净的模板DNA, 有效提高了扩增成功率。此外, 同时采用20μ L 扩增反应体系的梯度扩增法, 把检测到的图谱进行比较分析, 防止因脱落细胞量微造成的非特异性扩增, 以获取理想可靠的STR分型。
综上所述, 用本方法检验水中脱落细胞DNA, 可有效获得较为纯净的模板DNA, 明显提高检出率, 可为类似生物检材的检验提供一种可参照的方法。
The authors have declared that no competing interests exist.