国外上世纪80年代, 美国犯罪实验室主任协会/实验室认可委员会(ASCLD/LAB)即通过实验室认可标准提出了方法确认的要求。2002年国际实验室认可合作组织(ILAC)在ILAC-G19中要求对法庭科学实验室应用的所有方法进行方法确认, 指出鉴于法庭科学实验室的检验对象来源广泛、复杂和混合等特点, 提出在确定检验方法有效性时还应当考虑:抗干扰、样品同源性、特异性、组分稳定性和群体分布等, 显现出对法庭科学实验室检验方法的要求更加严格^{[4, 5]}。

美国法庭科学研究院(American Academy of Forensic Science(AAFS))1991年发布了法庭毒理学实验室指南(Forensic Toxicology Guidelines)^[6], 后经1998、2000、2002和2006年多次修订。指南中强调了方法确认时要注重基质的影响, 当分析非常规检材(例如腐败的检材、玻璃体液等)时, 应尽可能准备相同基质样品同步检测。并且给出了结果可接受的最大偏差应在± 20%之内以及保留时间的偏差应在1%~2%等指标。

英国和爱尔兰法医毒物学家协会(The UK and Ireland Association of Forensic Toxicologists(UKIAFT))2010年发布的法庭毒理学实验室指南(Forensic Toxicology Laboratory Guidelines)^[7]中明确提出了方法确认的7个参数, 包括专属性、范围、线性、精密度、准确性、回收率和稳定性。除与AAFS规定的结果可接受的最大偏差应在± 20%之内, 还特别规定结果在接近最低定量限(LOQ)时最大偏差可放大到± 30%之内。

瑞士认证服务部门委员会(the Sector Committee of the Swiss Accreditation Service (SAS))2013年2月修订的瑞士法医毒物分析实验室认可准则(Guidelines for Accreditation of the Swiss Laboratories Performing Forensic Toxicological Analyses)^[8]中列出了方法确认的11个参数, 除UKIAFT指南中专属性、范围、线性、准确性、回收率等5个参数外, 还增加了重复性、实验室准确性、复现性、最低检出限(LOD)、最低定量限(LOQ)和耐用性。并指出当方法确认的对象为标准方法或已出版方法时, 由科学界来进行确认工作; 当为内部建立方法或与以前确认过的方法有显著改动时, 则由法庭科学实验室自己进行确认。还强调所有内部确认记录都应当保存好, 以供将来参考。

世界毒物学家学会(The Inter-national Association of Forensic Toxicologists(TIAFT))发布的系统毒理学分析-实验室导则(Systematic Toxicological Analysis:Laboratory Guidelines)^[9]中规定, 所有方法均需验证其有效性, 并要通过以下参数对方法进行有效性确认:准确度, 精确度, 绝对回收率(不同浓度下), 线性范围, 选择性, 以及分析使用的时间、成本和稳定性。导则还阐述了以下几点:一、要在与检测样本相同的基质(如:血、血清、器官组织)中加入定量的药物, 然后进行分析检测。二、有效性的标准也要与分析检测的目的有关, 也就是说方法的检测限高, 并不一定有效性差。三、色谱定量方法优于其它经典方法, 如:紫外光谱法。因为色谱法能有效分离药物及其代谢物以及其它干扰杂质。四、在方法有效的前提下, 浓度范围应该足够大以包括所有可能浓度, 如:治疗量、中毒量和致死量。

除了上述原则性的规定外, 各国的毒物学家还在个案上进行了深入研究, 例如Valente-Campos^[10]等确认了指甲中可卡因及其代谢物的气质检测方法, 指出日内精密度小于11%等指标; Paquette V^[11]等确认了多种生物基质(包括肝脏、肺、脾脏、肾脏等)中超痕量铍的检测方法, 给出了组织中检测限0.02ng/g, 血液中0.03ng/mL等指标。此外, 在方法证实方面也提出了严格要求, 例如:澳大利亚国家检测机构协会(NATA)针对法庭科学领域使用的方法经常来自同行认可的文献、不太正规的会议论文和实验室内部手册, 提出了选择使用已确认方法, 首先必须证实程序中涉及的各项检测参数的可靠性, 至少要用已知物进行验证。当一项检测活动可用多个方法时, 有方法选择的标准。必要时, 要确立方法间的关联度, 并文件化^[12]。

国外与法庭科学毒物分析类似的生物医药领域已经对相关检验方法的确认进行了一定研究。美国食品药物管理局(FDA) 2001 年发布了“ 生物分析方法确证指南” 《Guidance for Bioanalytical Method Validation》^[13], 指出分析方法验证是论证某一分析方法适用于其用途的过程, 必须要有资料证明所用的分析方法是符合一定的准确度和可靠性要求, 规定了生物分析方法需确认准确度、精密度(重复性和中间精密度)、专属性、检测限、定量限、线性、范围、耐用性等指标以及可接受的标准。欧盟药品管理局(EMA)2009年发布了“ 生物分析方法确证指南” (European Medicines Agency. Guideline on validation of bioanalytical methods)^[14]中指出:一个生物分析方法的主要特征是确保其性能和分析结果可靠性所必需的, 这些特征包括:选择性、定量下限、校正曲线、准确度、精密度、基质效应、储备液以及工作溶液中分析物和内标在储存和处理全过程中的稳定性, 并规定了具体可接受的标准。

国际计量相关权威组织还发布了化学检测方法确认导则^{[15, 16]}, 指出实验室应通过试验方法的检出限、精密度、回收率、适用的浓度范围和样品基体等特性来对检测方法进行确认。实验室应能解释和说明检出限和报告限的获得。报告限应设定在一定置信度下可获得定量结果的水平。

此外, 很多导则和文献把不确定度的评估认为是方法确认中的基本要求。不确定度是表征合理的赋予被测量之值的分散性, 与测量结果相联系的参数。测量不确定是测量结果的一个属性, 而不是方法的属性。如果一个方法是在有足够统计方法控制下的, 那么一个典型测试结果的指示不确定度评估是可以被应用的。在被要求对测量之间有效对比或结果与要求之间的比对时, 不确定度的评定是必要的。实验室管理标准ISO/IEC17025和 ISO15189要求机构在需要时所报出的结果中需要带有不确定度。国际化标准组织(ISO)已经出版了不确定度的评估指引(ISO/IEC Guide 98-3, 2008) 和EURACHEM/CITAC不确定度及其应用的说明文件(EURACHEM/CITAC, 2000)等^[17]。以上方法确认因素方面所提到的信息可对测量不确定的估计起到很大的作用。这些数据也可以在相关方法下的日常质量控制和相关能力验证所取的结果作为补充。不确定度要评估到何种程度需要根据预期用途来确定, 原则上评估应满足测试的目的, 合理的不确定度评估可考虑长期精密度(实验室间再现性)和偏差。例如, 不确定度的重要贡献参数, 如标准物质纯度和溯源性, 以及可能被这些参量所覆盖的因素都需要包含在评估中。

早在上世纪80年代, 就有学者提出^[18], 对阳性的分析结果, 要考虑方法的特效性如何, 哪些物质有干扰; 对阴性的分析结果, 要考虑方法的灵敏度如何。同时, 提出了提取方法的回收率应在70%以上, 回收率不足50%的方法不宜采用。胡乃钊^[19]也指出, 如分析结果呈阴性, 则应该说“ 根据用某种方法分析, 未检出毒物” 。江焘^[20]对毒物分析方法的评价作了描述, 提出必须考虑方法的灵敏度、可靠性、线性、精密度及准确度。吴何坚等^[21]对毒物分析方法评价及质量控制进行了讨论, 提出了包括方法的特异性、选择性、最小检测限、最小检出限、线性、回收率、灵敏度、准确性和稳定性等评价指标。香港政府化验所对方法评价有线性范围、定量限、回收率、精密度等要求, 并规定每个样本2人各分析2遍, 在2人4人次分析中最大相差不超过3%等指标^[22]。

部分学者已经开始关注方法确认标准的建立工作, 如提出了我国至今没有建立起规范的毒物检验方法确认体系, 各种方法的建立、使用与确认大多是个案式的, 方法间可比性差, 对方法的可靠性、适用性、准确性等往往没有给予足够的重视与评估, 使得方法在使用中极易出现错用、滥用或无法发挥方法本身应有作用的情况。已有或新建方法被公众、学者、律师和司法机关接受的程度受到严重挑战, 对其重新进行确认评价势在必行^[23] 。

国内的生物医药、疾控卫生、检验检疫等相关行业, 都对检验方法的验证进行了一定研究, 有的已经制定成了行业规范, 但缺乏对方法确认的系统研究。

与毒物分析最接近的生物医药领域, 于2005年颁布的《化学药物质量控制分析方法验证技术指导原则》尚未涉及各具体指标在验证时的可接受标准, 但同时颁布的《化学药物制剂人体生物利用度和生物等效性研究技术指导原则》中规定了验证时可接受的标准。我国目前使用的药物分析教科书有多个版本, 大都用了大量篇幅对生物样品分析方法验证与基本要求进行了描述。在《法医毒物分析》^[24]等教科书中, 主要对专属性、标准曲线和线性范围、精密度与准确度、定量下限、样品稳定性、提取回收率、基质效应、质控样品、质量控制、测试结果等10个方面确认的基本要求做了讨论。

值得一提的是, 医药行业中, 同一分析方法用于不同的检测项目会有不同的确认要求。例如, 采用高效液相色谱法用于制剂的鉴别和杂质定量试验应进行不同要求的方法确认, 前者重点要求验证专属性, 而后者重点要求验证专属性、准确度、定量限。体现出方法确认的目的在于验证方法是否能满足应用要求, 也就是有效性的问题。与之类似的毒物定性定量分析中, 可以参考其确认方法, 采用定性检验与定量检验不同的确认方法。

与国外相比, 我国尚未规定方法确认的指标体系。这就造成方法间可比性差, 方法的可靠性、适用性、准确性、有效性等方面往往没有给予足够的重视与评估, 使得方法在使用中极易出现错用、滥用或无法发挥方法本身应有作用的情况。因此, 毒物方法确认的标准亟待建立。毒物检验方法确认标准和体系的建立将为今后检验工作中的方法确认与选择提供规范的操作程序, 将从根本上解决检验方法研究、制定、选择、确认和使用的难题, 为我国毒物分析领域的标准化工作打下坚实的基础。同时也将为处于不同地区、经济实力和条件下的鉴定部门提供方法的选择依据, 应成为毒物分析工作者关注的焦点问题。

随着实验室认可活动的发展, 越来越多的实验室都具有了方法确认的程序, 对检测方法的选择、检测方法的证实及确认、方法偏离的控制、方法变更等做出了明确规定, 但是程序规定与现实脱节, 方法使用比较混乱。一是在认可实验室中, 虽有确认程序的规定, 但较少能真正实施。例如, 方法应用的随意性较大, 方法偏离现象比较普遍, 大多数未经过严格的技术判断与确认。二是方法的适用范围不清晰, 同一方法对于血液、肝脏、肺、十二指肠等多种检材是否都能适用, 研究不深入。三是对于线性范围、检出限等指标没有规定或规范不严谨。

国外法庭科学领域对于毒物检验方法的确认研究, 虽然对我们有一定启示作用, 但我国的毒物检验极具中国特色, 无论是毒物种类还是检材类别, 都与国外差异很大, 这就要求我国毒物分析工作者必须自力更生, 根据自身工作特点和经验, 尽快建立适用于我国国情的毒物检验方法确认标准。