引用本文
管桦, 李英, 荣海博, 赵颖, 阮德林. 磁珠DNA自动提取系统在法医检验中的应用[J]. 刑事技术,2013,38(5): 29-32
GUAN Hua, LI Ying, RONG Hai-bo, et al. Application of the automated DNA extraction system with magnetic beads in forensic testing[J]. Forensic Science and Technology,2013,38(5): 29-32  
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磁珠DNA自动提取系统在法医检验中的应用
管桦, 李英, 荣海博, 赵颖, 阮德林
公安部第一研究所,北京 102200

作者简介:管桦(1983—),女,北京人,助理工程师,工学硕士,主要从事法医遗传学检验研究。Tel:15810071770

摘要

磁珠DNA自动提取系统是将磁珠分离技术与DNA自动提取工作站结合运用,以达到高效提取DNA的目的,它具有操作时间短、准确性高、检材用量少等特点,特别适用于大批量生物检材的快速提取,是目前主流的DNA自动化提取方法。本文对磁珠DNA自动提取系统的基本组成、工作原理、操作流程及其在法医检验领域中的应用等进行了综述,并对该系统的发展前景进行了展望。

关键词: 法医物证学; DNA自动提取系统; 磁珠; 法医检验
中图分类号:DF795.2 文献标志码:A 文章编号:1008-3650(2013)05-0029-04
Application of the automated DNA extraction system with magnetic beads in forensic testing
GUAN Hua, LI Ying, RONG Hai-bo, et al
The First Research Institute of the Ministry of Public Security, Beijing 102200, China
Abstract

The automated DNA extraction system with magnetic beads is an automated DNA extraction instrument combined with magnetic separation technology. This article mainly introduces the basic composition, working principle, operation process and application in the forensic testing of the system, and looks into the future development of this system.

Keyword: forensic biological evidence; DNA extraction system; magnetic beads; forensic testing

20世纪80年代在法医学领域里最大的进展莫过于DNA鉴定技术的出现和应用, 从1985年英国遗传学家Alec Jeffreys建立DNA指纹技术开始至今, 它为形形色色的案件侦破提供了强大的科学证据。今天DNA分型已成为越来越多的法医实验室日常采用的支柱技术, 其应用范围更加广泛, 在案件数量逐年递增的情况下, 法医检验工作者常常要面对案件积压和法医实验室管理难度增大的困境[1], 而从各种检材中提取DNA的过程仍是进行DNA分型检验的一个限速步骤。为了增加检验吞吐量, 可高通量提取生物检材DNA的自动提取工作站应运而生, 它是依靠生化技术对生物性检材进行批量处理的全自动化工作平台, 它的应用极大地提高了法医DNA多态性分析的效率[2]。同时, DNA自动提取工作站结合基于功能磁性纳米颗粒的样本提取与处理技术(即磁珠分离技术), 可以保证实验结果的稳定, 避免了人工操作引起的差异及错误[3]。因此, 由上述两种技术相结合孕育而生的磁珠DNA自动提取系统正逐渐成为在DNA分型检验的检材纯化步骤中被广泛普及和应用的主流方法之一。

1 磁珠DNA自动提取系统的概述

检测DNA首先需要对DNA进行分离纯化。传统的分离常为手工操作, 提取纯化的步骤十分繁杂、DNA回收率低, 并伴随有PCR扩增反应的抑制剂或其他干扰准确定量组分的残留等缺陷。磁珠DNA自动提取系统能很好地克服传统常规方法的种种缺点, 实现样品的快速高效制备, 目前在数据库实验室这种方法已普遍被应用, 而一些较大规模的法医检验实验室也正逐渐采用这一手段进行案例检材的检验分析[4]。

1.1 DNA自动提取工作站的基本组成与功能

DNA自动提取工作站(如图1)主要包括以下几个功能模块:精确移液模块、机械抓板臂、振荡模块、精确温控模块、工作台面以及操作界面(计算机), 通过对各个功能模块的高度整合从而实现核酸提取等过程的高通量自动化。

图1 DNA自动提取工作站示意图

DNA自动提取工作站的移液模块可配备多种通道液体处理臂, 加样量范围高, 液体处理能力强。工作台面可细分为主、副两个区域, 前者放置待检测的培养板、试管架、试剂盒、枪头盒等, 后者可供样品的临时停放, 而机械抓板臂可实现样品在主副工作台之间的转移, 并进行加样、洗脱、稀释等操作[2]。振荡模块实现对混合溶液进行高效稳定的自动化振荡混匀。精确温控模块可以满足实验中对不同温度的需要。计算机装载可直观对仪器进行管理的操作软件, 对整个实验流程进行实时监控和管理。同时, 工作台配有条形码阅读器, 可以进行条码追踪或自动分配特定识别码, 与实验室信息系统进行双向通讯。另外, DNA自动提取工作站能整合其他实验设备, 如酶标仪、洗板机、离心机、PCR仪, 或是其他储存和孵育设备, 并根据不同的实验目的, 对仪器运行过程自由设定, 全程计算机自动监控完成操作。

1.2 磁珠分离技术的原理和操作流程

磁珠分离技术采用硅涂层磁性树脂, 在高亲和力试剂(如胍盐)的存在下结合DNA分子[5], 达到提取DNA的目的。因为这项技术无需离心和过滤, 无需使用有机溶剂及其他有毒试剂, 所以操作可实现高通量自动化, 特别适用于全自动工作站[6]。磁珠分离技术包括以下几个步骤:(1)吸附:在样品裂解液中加入磁珠, 充分混合, 裂解细胞, 释放的DNA特异性吸附到磁珠上, 蛋白质等分子则不被吸附而留在溶液中; (2)分离:在磁力架磁场作用下, 磁珠与溶液分离, 吸弃分离后的溶液; (3)洗涤:加入洗涤液, 反复洗涤, 去除杂质; (4)洗脱:吸弃洗涤液后加入洗脱液, DNA就从磁珠上洗脱下来, 最后再通过磁场作用, 使磁珠与洗脱下来的DNA分离, 随后将洗脱下来的DNA溶液转移到收集板中, 就完成了DNA的提取。

1.3 磁珠DNA自动提取系统的优点

磁珠DNA自动提取系统采用自动化程度高的DNA自动提取工作站作为人工提取DNA的替代品, 具有自动化程度高, 能够完成复杂的操作, 满足高通量检材的高效模板制备的需求, 有效地解决了法医物证鉴定中不断增长的DNA检材量的问题[7], 加快了检材的处理速度, 减少了案件的积压[8]。整个操作系统具有以下优点:(1)用时短。整个提取过程随着样本数的增加, 操作时间较人工操作用时明显递减[9, 10]; (2)DNA提取质量高。即便是微量检材或陈旧样本, 磁珠DNA自动提取系统也能高效地分离纯化DNA用于后续检验; (3)灵活性高。可通过操作界面依据实验目的灵活编程, 设定模块布局, 并能实现各种实验器具的样本转移; (4)自动化程度高。只需进行简单几步程序编排便可轻松实现整个DNA提取过程的自动化操作; (5)操作精确度高。移液模块一般采用液压原理的移液设计, 保证移液的精确性和均一性。单个磁珠表面吸附的DNA量比较恒定, 实现了粗定量的目的。此外, 整个系统实现了生物性检材的批量统一处理, 减少了人工操作带来的误差; (6)操作可监控。计算机监控可追踪并记录每一个执行操作, 对于操作过程中的突发情况能够迅速识别; (7)无污染。系统完全自动化操作, 减少了人为干预, 降低了样品污染的可能性[11]; (8)利于后续实验进行。DNA自动提取工作站结合了磁珠分离技术, 可以除去许多影响后续聚合酶链式反应(PCR)的杂质, 提高PCR扩增的稳定性[12]; (9)应用广泛, 检测效率高。

2 磁珠DNA自动提取系统在法医检验中的现状

DNA分型是目前法医检验的主流方法, 而对DNA的提取则是检验的首要和关键环节, 样品检验结果的准确性直接与获得的DNA质量的好坏有着重要的联系。因此, 对DNA的提取方法的研究, 一直处于探索和发展的阶段, 各种方法层出不穷, 并经受实践的检验。磁珠DNA自动提取系统是由此孕育而生的一种较为年轻的DNA提取方法, 经大量实验证实, 它较传统的DNA分离方法具有更为突出的优势, 并为许多法医实验室所逐渐推广和广泛应用。并且, DNA自动提取工作站在全国的保有量近些年呈上升趋势, 而中标企业多为国外厂商。据统计, 2008年, 我国共有25个省、市级公安系统采购了DNA自动提取工作站, 而到2011年底, 这一数字升至104个, 应用领域主要为法医DNA数据库建设和案件检材的批量检验。

2.1 DNA数据库建设中批量样品的DNA提取

1990年以后, PCR技术的出现, 大大提高了法医DNA分析技术的灵敏度。也对DNA数据库建设产生了巨大的推动作用。在建库过程中, 除提高样品通量外, DNA的提取质量显得更为重要, DNA自动化提取已成功应用于法医数据库样本的提取检验中。

姜先华、侯光伟等[13], 于2007年在国内首先建立了应用自动化工作站进行大批量血斑PCR-STR基因分型检测的自动化新方法。2009年, 匡金枝等人, 选用自动化提取、加样工作站, 采用磁珠法及Chelex® 100 法对各类涉案生物检材进行DNA提取和比较测试, 结果显示:1552份各类检材采用工作站-磁珠法提取DNA效果最佳, STR检测成功率为95%; 92个样本同期检测, 自动化工作站较手工操作DNA检案时间可缩短1.25倍[9]。

2.2 不同生物性检材DNA的提取

DNA提取自动化工作站的应用范围已涉及血(痕)液、精(斑)液、唾液(斑)、指纹等生物性检材。目前, Beckman Biomek系统结合Promega公司的DNA IQ 和AluQuant 试剂已经应用于DNA样本提取和定量的自动化操作。2002年Greenspoon S. A.等采用Biomek® 2000 和 DNA IQ系统对不同稀释浓度下的混合斑拭子进行检验发现, 即使精子DNA含量十分有限, Biomek® 2000 /DNA IQ系统也能完成提取, 并且多数情况下, 该系统提取效果好于人工提取的效果[10]。到2004年Greenspoon S. A.等人又成功地从性侵犯(混合斑)样本、烟头、血痕、口腔拭子以及其他各种组织样本中提取了DNA, 整个过程均未出现污染[8]。2005年Shawn A等分别采用磁珠分离技术和有机提取法对胎儿组织、尿液、血液(血卡和液态血)及烟蒂样本进行DNA提取, 全程通过BioRobot EZ1工作站完成所有操作。结果表明, 磁珠分离法结合自动化提取工作站能简化DNA提取的过程, 并有效的去除了PCR抑制物, 获得的DNA质量更好[1]。2007年, 严江伟等人选用Biomek® 3000自动化工作站, 采用DNA IQTM系统及Chelex法对法医案件中常见生物样本(血痕、烟蒂、毛根、精斑和软骨)进行DNA提取, 结果DNA IQTM系统无论手工还是自动化, 提取到的DNA模板量大致都为1ng/μ L, 而Chelex系统提取到的DNA模板量参差不齐, 即使是同一类样本, 提取到的DNA模板量也有很大差别, 这使得后续STR检验的成功率受到影响[14]。

2.3 微量生物检材DNA的提取

随着DNA技术的普及, 现场勘查人员已能够对不同生物性检材正确发现并高效提取。但微量DNA, 也称低拷贝模板(Low Copy Number, LCN)DNA, 即低于50pg的DNA, 常规方法难以检测到理想的DNA图谱, 是法医DNA检验难点之一。

2011年, 高林林等人通过Eppendorfep Motion® 5057LH 工作站结合DNA IQTM系统提取脱落上皮细胞类生物检材DNA, 并用Identifiler 试剂盒进行STR检验。结果近一半的生物检材获得13个基因座以上的STR分型, 最高检出率达到73.44%, 说明脱落上皮细胞类检材应用自动化工作站提取DNA模板可在法医日常检案中广泛应用[15]。

2.4 陈旧检材DNA的提取

法医DNA检验的另一难点是对陈旧检材的DNA的提取。对于陈旧血样的大批量检验, 由于细胞和载体结合比较紧密, 模板DNA在一定程度上发生降解, 提取成功率往往较低, 难以获得满意的结果[16]。因此, 郝宏蕾等于2011年对大批量陈旧血样DNA自动化提取过程进行了改良, 增加了56℃下TNE混合液提前消化90min、提高裂解液加入量及裂解温度的步骤, 提取过程全部由Freedom EVO150-8型工作站完成, 结果证明, 改良磁珠法显著提高了此类陈旧样本的批量检验成功率[17]。

2.5 研究性实验的应用

当前, 磁珠DNA自动提取系统不仅服务于实际的案件排查检验, 对法医检验领域涉及的研究性实验也起到了相当大的作用, 为法医检验技术的发展和创新做出了贡献。

2009年, 焦志等人采用国内新近研制的小型DNA自动提取仪MP-120结合自制磁性微球提取试剂对72份血斑检材进行DNA提取, 结果所有样本的基因分型均能成功检测到, 检测成功率为100%[18]。2010年, 孙敬等[19]扩展了MP-120自动化工作站的应用范围, 证实其广泛适用于血斑、唾液斑、精斑、毛发(毛囊)、肌肉、肋软骨、腐败组织、脱落细胞等的批量提取。此外, 王玉建等于2010年研究了不同稀释度胍盐裂解液对自动化提取工作站DNA回收效率的影响, 实验制备了不同浓度的DNA样本, 并将EQ1000法医DNA提取试剂盒中的胍盐裂解液梯度稀释, 在Freedom EVO 100-4型自动化提取工作站上运行“ 工作站-磁珠法” 提取程序, 比较不同稀释度胍盐裂解液的处理对样本DNA回收效率的影响, 结果表明DNA回收效率受胍盐裂解液浓度的影响[20]。

3 展 望

应用于法庭犯罪学领域的法医DNA分型技术的普及和发展, 有力地证明了这种技术的惊人潜力, 它不仅可以证实犯罪, 而且还可以还无辜者清白[21]。但是, 近年来各地案件侦破和DNA数据库建设中涉及到的各种问题, 如微量检材和陈旧检材的提取, 检验效率有待提高以及检验费用昂贵等, 对法医DNA检验提出了更高要求。DNA的提取, 是DNA检验的第一步, 也是最重要的环节之一, 它直接影响到后续实验的成败, 值得尤为关注。

磁珠DNA自动提取系统的出现为DNA提取提供了更为有效的提取平台, 它使得DNA的提取过程更加的简易, 操作更加便捷, 避免了人为因素为实验带来的误差和污染, 在保证提取质量的同时缩短了实验的整体时间, 同时, 使提取更加的精确和均一。然而, 目前国内的磁珠DNA自动提取系统仍处于初级阶段, 仅具备DNA提取、纯化和样本分装等程序的自动化。从长远意义上来看, 仍需要进一步实现“ 集成化” 、“ 微型化” 和“ 精细化” , 以求达到更为人性化的操作, 彻底实现解放劳动力, 同时降低实验成本的目的。

“ 集成化” 是要求各个功能模块能够按实验目的的不同进行整合操作。对于法医检验来说, 其整个流程应该包括样本前处理, DNA提取、纯化、定量, DNA扩增前混样, DNA扩增和扩增产物的电泳分析。这就意味着在不同的实验中, 所有模块均能灵活的布局, 多种设备如洗板机、离心机、PCR仪、电泳检测设备等可以联合使用, 以此期待能够将检测方法在仪器上完美呈现, 实现真正意义上的自动化操作。

“ 微型化” 是希望磁珠DNA自动提取系统小型化, 以适应不同环境的要求。但是, 需要注意的是, “ 微型化” 的内涵不是简单的外观缩小, 而是采用先进的技术和设计理念, 在保证仪器功能性的同时, 对体积进行压缩, 满足小型实验室的设计需要。

“ 精细化” 是对各部件设计的更高要求, 以期达到更加人性化的目的。如考虑到实验的不同需要, 在DNA自动提取工作站的移液模块设计中设计不同类型的液体处理臂, 同时, 采用可重复清洗使用的移液处理臂进样端替代一次性枪头设计, 以此降低实验成本。还有在实验运行前可以帮助实验人员检查实验方法的3D仿真模拟工具的研发等, 都是“ 精细化” 设计的良好开端。

目前, 我国的磁珠DNA自动提取系统仍然主要依靠国外的技术支持, 这在很大程度上制约了国内法医检验领域的发展, 尽快解决这方面的关键问题, 开展相关研究, 研制出具有自主知识产权的完整高效的磁珠DNA自动提取系统, 打破国外此类产品在国内的垄断地位, 是一项值得深入探索和攻关的课题。

The authors have declared that no competing interests exist.

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